免疫细胞的检测

1、免疫学检测与免疫学技术一、抗原抗体的检测技术二、免疫细胞的检测三、细胞因子的检测四、免疫相关基因分析五、免疫标记技术六、免疫PCR(IM-PCR)技术七、杂交瘤技术与T细胞克隆技术八、新型抗体的制备技术九、抗原的制备技术一、概述免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究中的应用o免疫事技术的应用极为广泛，疾病的诊断、疗效评价及理论研究等。二、抗原抗体的检测技术*根据反应的基本原理与表现主要分为凝集反应、沉淀反应和补体参与的各种反应*根据抗原抗体反应设计的试验还有标记抗原（或抗体）检测相应物质的标记技术。免疫细胞的检测对

2、机体参与免疫应答的细胞进行鉴定，计数及功能测走(一)细胞计数荧光抗体染色免疫酶染色技术:*ABC法*APAAP法3免疫金银染色法(IGSS)免疫细胞化学法四聚体法TCRP链测定(二)免疫细胞功能的测定1.T细胞功能测定：肿瘤，病毒感染，免疫缺陷，自身免疫病等细胞增殖(转化)试验：可分为非特异性丝裂原和特异性抗原两类。*丝裂原主要有PHA、ConA和PWM；*抗原刺激物有破伤风类毒素、PPD和白色念珠菌等；*同种MHC及抗CD3单抗等*肿瘤细胞自体淋巴细胞混合培养(2)T细胞介导的细胞毒试验：CTL分泌功能检测T细胞功能的体内检测法*接触性超敏反应*移植物抗宿主反应(GVHR)*识帶型招2.B细

3、胞功能判定(1)B细胞增殖(转化)试验：*PWM、SAC,LPS(对小鼠B细胞)；*抗胞M抗体及EB病毒等(2)溶血空斑形成试验(3)反向溶血空斑试验酶联免疫斑点法(ELISPOT):ELISPOT是一种可检测抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。*此法的主要优点是:稳定、特异，且抗原用量少;可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量测定；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。3.NK细胞活性测定体外检测NK细胞活性的方法有形态学检查法，放射性核素释放法，酶释放法，化学发光法及流式细胞术等。测定人NK细胞活性常以K562细胞株作为靶细胞，测定小鼠NK细胞活性常用YAC1细胞为靶细胞。形

4、态学检查法放射性核素释放法：用放射性核素(510、1251UdR)标记靶细胞。酶释放法：测定靶细胞膜受损后从胞浆内释放至介质中的乳酸脱氢酶(LDH)活性。*NAG酶荧光比色法:NAG酶是细胞浆中存在的一种溶酶体酶，与其底物作用后，生成荧光产物，应用荧光分光光度计测定，敏感性明显高于LDH比色法。而且方法简单，结果稳定，重复(4)化学发光法(5)流式细胞术：应用FCM检测NK细胞活性是根据PI染料排斥法。PI渗入死亡细胞内与DNA和RNA结合，在488nm波长激发下产生绿色荧光。此法既可以测定单个细胞毒活性，也可以用于总细胞毒活性试验。*还可利用荧光染料法，细胞光扫描法，双标记细胞毒法测定细胞毒

5、性细胞的杀伤效应。4.吞噬细胞功能测定中性粒细胞趋化功能测定：一般釆用滤膜渗透法(Boyden小室法)或琼脂糖平板法。中性粒细胞吞噬、杀菌功能测定显微镜检法NBT试验：此项试验是测定中性粒细胞吞噬、杀菌功能的一种简易方法。化学发光测定法：中性粒细胞在吞噬过程中出现呼吸爆发，产生活性氧代谢产物。此类活性氧化基团与细胞内杀菌作用密切相关，同时又能激发细胞内某些物质产生化学发光。(4)巨噬细胞细胞毒测定:通常取小鼠腹腔巨噬细胞，以尸干扰素为激活剂使其活化，作为效应细胞。用125I-UdR标记的DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815作为靶细胞。(3)巨噬细胞吞噬功能测定：中药斑螯酒精浸液敷贴法诱发无菌性皮炎

6、，从皮肤水泡渗出液中收集巨噬细胞，在体外进行鸡红细胞吞噬试验，计算吞噬率和吞噬指数，作为判断巨噬细胞吞噬功能的指标。四、细胞因子的检测（一）免疫学检测法免疫学检测的基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。如免疫斑点法、ELISA法、RIA法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。某些细胞因子含量甚微的样品（如脑脊液）可用免疫聚合酶链反应（immuno-PCR）进行检测。（二）生物学测定法根据细胞因子对特定的生物学活性，应用相应的指示系统，同时与标准品对比测定，从而得知样品中细胞因子的活性水平，一般以活性单位（U/ml）表示。靶细胞可直接从组织中分离，如骨髓细胞的集落形成试验和胸腺细胞（脾细胞）

7、的增殖试验,或用体外培养的依赖细胞因子才能生长的细胞因子依赖株及对细胞因子杀伤敏感的细胞作为靶细胞。1.促进细胞增殖和增殖抑制法*多种IL、表皮生长因子、转化生长因子a、神经生长因子、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子*各种CSF作用于造血系统的不同细胞，可促进其增殖及在半固体琼脂凝胶系统中克隆培养骨髓细胞的集落形成，故可采用集落形成试验研究CSF的水平*常用的检测细胞增殖的方法有3HTdR掺入法、比色法、染色法和直接计数法等。其中测定细胞代谢酶反应细胞增殖数的比色法包括MTT、XTT、MTS和NAG等方法。2.细胞毒活性测定法许多细胞因子(TNF)针对转化的细胞及病

8、毒感染的细胞具有溶细胞或抑制细胞生长的活性。3抗病毒活性测定法常用于检测抗病毒活性的细胞株有WISH,Hep2/c,L929,A549和MDBK等。其中WISH和Hep2/c细胞株用以检测人干扰素,L929细胞株用于检测小鼠干扰素,Ratec细胞株用于检测大鼠干扰素，而MDBK细胞株则可用于检测多种族的IFNa和IFNy。常用于攻击细胞的病毒有滤泡性口炎病毒(VSV)、鼠脑心肌炎病毒(EMCV)以及Sindbisvims等病毒。检测抗病毒活性的方法:测定细胞因子抑制病毒的致细胞病变效应(CPE)、抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量等。4趋化活性测定法多种细胞因子具有趋化活性，分别能诱导中性粒细胞

9、、单核/巨噬细胞和淋巴细胞定向迁移趋化因子诱导细胞移动的方式包括趋化性和化学增活现象。化学增活现象(chemokinesis)是指增强趋化性(chemotaxis)是指诱导细胞向趋化因子化学浓度高的方向作定向移动，可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验测定细胞因子的趋化活性；细胞的随机运动,可采用琼脂糖小滴化学动力学试验检测o（三）分子生物学测定法RNA印迹法、核酸酶保护分析、原位杂交、PCR和RealTimePCR等。亦可通过检测细胞内细胞因子的基因组成或mRNA量，推算出细胞因子的合成量。-:*r-诱导肿瘤细胞凋亡-抗肿瘤*肿瘤细胞高表达FasL-诱导免疫细胞凋亡抑制免疫功能逃避免疫监视*肿瘤细胞

10、低表达或不表达Fas-逃避免疫监视2.细胞凋亡与免疫学的关系*细胞凋亡与T细胞在胸腺的发育*细胞凋亡与成熟T细胞：AICD*细胞凋亡与与B细胞*细胞凋亡与胞毒效应3细胞凋亡参与自身免疫病的发生4细胞凋亡与病毒感染*抗病毒免疫防御*细胞凋亡与AIDS*细胞凋亡与病毒性肝炎细胞凋亡的检测方法、形态学方法1普通光学显微镜检测法2.荧光显微镜检测法材料：石蜡切片;冰冻切片;细胞学涂片。方法一：PI染液：碘化丙(propidiumiodide,PI)；DAPI染液；AO染液：*荧光显微镜下观察。PI染色选用600nm的激发光,DAPI选用460500mn的激发光,AO染色选用520mn的激发光。*HE染

11、色核DNA呈蓝色，而PI染色呈红色,DAPI染色呈蓝白色,AO染色呈黄绿色。凋亡细胞呈现核浓缩，染色加深,或核染色质呈新月形聚集于核膜一边;晚期凋亡细胞表现为核碎裂成大小不等的圆形小体被细胞膜包绕，即凋亡小体。方法二：Hoechst33342/PI双标记法*在荧光显微镜下观察，凋亡细胞的蓝色荧光比活细胞和非凋亡细胞都要强，其光散射能力则降低，将二者结合起来,可以很好地鉴定凋亡细胞。坏死细胞则由于PI复染，呈红色荧光。是目前细胞凋亡最满意的形态学分析方法。*样品来源培养细胞或离体细胞制成的单个细胞悬液。方法三：碘化丙喘(PI)和Hoechst33342(HO)双染法PI和HO均可使用紫外光激发，

12、其荧光分别为红光和蓝光。对照活细胞的HO蓝色荧光最强，而早期凋亡细胞由于其DNA降解和丢失，其HO蓝色荧光较弱,也有很弱的PI红色荧光。晚期凋亡细胞PI红色荧光增强，坏死细胞PI红色荧光最强，而HO蓝色荧光较弱。.凋亡小体的电镜观察小体系由细胞、生物化学方法电泳法DNA梯带(DNAladder)。雪三、免疫学方法（ELISA法）IB*细胞凋亡的发生，是由于内源性核酸内切|酶的激活，核小体间区双链DNA解开，产生/舅单/低聚核小体片段，而核小体DNA由于与鬆鑿组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成紧密复I合物而不被核酸内切酶裂解。釆用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体，与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的单/低聚核小体。四、原位末端转移酶标记技术（TdT或TUNEL）凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活，核DNA被切割成许多双链DNA片段