(整理)脂质代谢关键蛋白质的功能与调控机制cb919000-g

1、精品文档项目名称：首席科学家：脂质代谢关键蛋白质的功能与调控机制宋保亮中国科学院上海生命科学研究院起止年限：2009.1至2013.8依托部门：中国科学院一、研究内容（一）拟解决的关键科学问题脂质代谢包括合成、吸收、运输、贮存等动态过程，主要由膜蛋白复合物介导实现，并且在多个水平受到调控，包括一些重要转录因子对脂质代谢关键基因的表达调控作用。脂质代谢过程中涉及到膜蛋白复合物、核转录因子和小分子代谢物组成复杂的相互作用网络。其中的关键蛋白是重要的调控点，这些蛋白的功能紊乱和调控失衡将直接导致严重代谢性疾病的发生。本项目拟解决的关键科学问题是（1）发现脂质代谢关键蛋白质复合物的组成和动态变化规律；

2、（2）阐明脂质代谢关键蛋白的功能调控和重要信号转导途径；（3）揭示脂质代谢关键蛋白的生理功能和在重大疾病发生发展中的作用；（4）鉴定以脂质代谢关键蛋白为靶点的活性小分子化合物。以上研究成果不仅对蛋白质科学、脂质代谢、信号转导等学科的基础理论有重要贡献，而且有助于解析重要生命活动的基本规律，为研究心脑血管疾病、脂肪肝、糖尿病和肥胖等重大疾病的发生机理、疾病早期诊断和治疗奠定重要基础。（二）主要研究内容本项目将围绕脂质的合成、吸收、运输、贮存等过程，针对其中的关键蛋白质和调控因子开展研究。力图将大规模和系统的蛋白质相互作用网络分析与经典的科学假设驱动的研究策略相结合，将蛋白质复合物的功能研究从整体

3、与局部两个方面有机的结合起来，分析蛋白质在脂质代谢中的分子调控机制和整体功能作用，寻找其功能调控在生理与病理状态下的动态变化。阐释重要蛋白质在脂质代谢中的功能与调控机制。系统地分析脂质代谢过程中重要蛋白质之间的相互作用，鉴定新的结合蛋白。通过规模性的蛋白质相互作用筛选方法，我们将重点研究脂质代谢调控过程中重要核转录因子复合物、脂质合成与吸收过程中的膜蛋白复合物以及脂质运输和贮存过程的蛋白质复合物等。深入探讨蛋白质介导的脂质代谢动态变化过程。通过动态定量脂质分析技术，并结合其它现代生物学的研究方法，分析蛋白质和脂质分子的相互作用，动态转运和定位变化。解析重要信号转导途径对脂质代谢关键蛋白质的调控

4、作用。脂质代谢过程产生大量的小分子代谢物和衍生物，它们中相当一部分具有调控活性，能够前馈或反馈作用于脂质代谢关键蛋白，对相应的代谢途径产生重要影响，本项目将发现并揭示该类信号转导途径，阐明其生理功能。解析脂质代谢关键蛋白质功能调控异常在重大疾病发生发展中的作用。利用细胞、动物模型和病理样本，开展脂质代谢关键蛋白在心脑血管疾病、脂肪肝、糖尿病和肥胖发生发展中的分子病理学机制研究。构建筛选活性小分子化合物的靶点系统，进行高通量筛选获得各种活性小分子化合物。鉴定具有功能作用的小分子化合物，进行构效优化获得先导结构分子等研究争取深入相应药物的研发。二、预期目标(一)总体目标本项目针对脂质代谢关键蛋白的

5、功能与调控机制开展前沿领域研究，系统地分析蛋白质复合物的组成、相互作用、动态变化及在脂质代谢中的功能调控作用。鉴定脂质代谢中重要蛋白质复合物的组成和作用机制，发现新的调控机制和信号途径，揭示其在脂质代谢中的作用机理，阐明其在心脑血管病、糖尿病和肥胖等重大疾病发生发展中的病理学意义，并筛选获得活性小分子化合物。以上研究成果必将为脂质代谢和蛋白质科学的基础理论增添新的内容，为我国人口与健康事业做出重要贡献。本项目的实施将获得一系列具有国际领先和拥有自主知识产权的研究成果，打造一支达到国际先进水平的研究脂质代谢相关蛋白质的科研队伍，跻身于国际蛋白质科学研究的领先行列。(二)五年预期目标1.在基础理论

6、研究方面：从分子、细胞到动物整体水平，发现脂质代谢关键蛋白质复合物的组成、新途径及新相互作用，阐明生理和病理状态下蛋白质相互作用关系；鉴定脂质代谢关键蛋白的重要功能调控和发现新的信号转导途径，发现重要的调控点和作用机制；阐明脂质代谢关键蛋白在脂类分子合成、吸收、运输、贮存中的功能作用，揭示其生理功能和在重大疾病发生发展中的作用；发现以脂质代谢关键蛋白质为靶点的活性小分子化合物，鉴定具有功能作用的小分子化合物，进行构效优化获得先导结构分子等研究，并在动物水平分析获得其对脂质代谢和心脑血管疾病、糖尿病和肥胖等疾病的作用。2.在应用基础研究方面：鉴定三种以上可供心脑血管疾病、糖尿病和肥胖等代谢性疾病

7、诊治与新药开发等研究的重要靶标，开发和建立蛋白质复合物特别是膜蛋白复合物动态变化研究的新方法和新技术，申请8项以上发明专利，促进有自主知识产权新药的开发及产业化。3.成果考核指标：在国际一流杂志（IF10）发表论文8-10篇，在有影响力的杂志（IF5）上发表论文20-40篇。4.人才培养：培养博士研究生30-50人，国家杰出青年等高级人才3-5名。三、研究方案（一）学术思路脂质代谢是生命活动的重要事件，并与重大疾病的发生密切相关。蛋白质是脂质代谢及其调控的主要执行者，认识脂质代谢关键蛋白质分子的生化特性及其相互作用将有助于解释脂质代谢调控的规律、阐明重大疾病的发病机制，为药物靶点的发现和药物开

8、发提供实验基础和理论依据。本项目主要从脂质代谢关键蛋白质复合物的组成和动态变化规律、重要信号转导途径、生理功能、病理作用和与之相互作用的小分子等方面着手，应用现代生物学（包括生物化学、细胞生物学、蛋白质组学等）技术，研究脂质代谢关键蛋白质动态变化及其对脂质代谢的作用，揭示其与重大代谢性疾病（如动脉粥样硬化、冠心病、中风、糖尿病、脂肪肝、肥胖等）发生发展的内在关系，创建我国脂质代谢关键蛋白质及其复合物的功能研究的基础理论和技术体系。（二）技术路线蛋白质几乎介导所有的生命活动，在脂质代谢领域的关键蛋白，又有其显著特点，如脂质代谢涉及较复杂的膜蛋白复合物；有代谢小分子与蛋白质的直接相互作用与调控；以

9、及有很强的应用前景。因此，本申请项目首先在分子水平研究脂质代谢关键蛋白质复合物的组成、功能调控、重要信号转导途径；其次在动物整体水平分析重要蛋白因子对脂质代谢和疾病发生的影响，同时利用病理样本开展病理学研究；最后基于这些前沿进展，构建以脂质代谢关键蛋白质为靶点的活性小分子化合物筛选系统，筛选获得具有临床应用前景化合物。本项目从分子水平揭示蛋白质的功能调控机制，在整体水平阐明其生理和病理作用，并最终旨在研发新型调脂药物。本项目针对细胞内脂质代谢的动态过程设置了相应的三个研究课题，包括：（1）脂质代谢调控的关键转录因子；（2）脂质合成与吸收的关键膜蛋白及其复合物；（3）脂质贮存和运输密切相关的重要

10、蛋白。总体技术途径如下图：酵母双杂交、免疫共沉淀结合质谱技术等鉴定相互作用的新蛋白（三）可行性分析本研究项目的总体研究方案切实可行从学术思路上，本项目拟从脂质代谢关键蛋白质复合物的组成和动态变化规律、重要信号转导途径、生理功能、病理作用和与之相互作用的小分子等方面着手，应用现代生物学（包括生物化学、细胞生物学、蛋白质组学等）技术，研究脂质代谢关键蛋白质动态变化及其对脂质代谢的作用，揭示其与重大代谢性疾病（如动脉粥样硬化、冠心病、中风、糖尿病、脂肪肝、肥胖等）发生发展的内在关系，创建我国脂质代谢关键蛋白质及其复合物的功能研究的基础理论和技术体系。由于蛋白质脂质代谢及其调控的主要执行者，蛋白质功能

11、异常是重大疾病发生的重要原因，因此以脂质代谢关键蛋白质等科学前沿作为切入点，研究脂质代谢调控和疾病的关系切实可行。从技术途径上看，本项目设置三个课题，以脂质代谢关键蛋白的重要调节功能为主线，蛋白质与蛋白质相互作用为共同的主题，应用蛋白质科学和其它现代生物学的技术（如酵母双杂交系统、免疫共沉淀技术、质谱分析、脂质代谢分析、高通量化合物筛选等），寻找脂质代谢关键蛋白在生理与病理状态下的功能变化，阐释其生物学功能与调控机制。三个具体研究课题的技术途径和路线清晰和明确，切实可行。本研究项目凝聚了优秀的研究团队本项目有高级职称人员9名，其他研究技术人员22名，平均年龄为34.3岁。研究队伍包括“国家杰出

12、青年基金”获得者3名、中科院“百人计划”入选者5名。本项目凝聚的优秀研究团队，确保了本项目切实可行。研究团队成员已经承担多项本研究项目相关项目，其中包括国家“十五”科技攻关计划课题、科技部“973”项目、科技部“863”项目、国家自然科学基金重点项目、国家杰出青年基金、国家自然科学基金创新团队和国际合作项目。特别是具有相关国家级重大/重点项目顺利实施的丰富经验，扎实的工作基础确保了本研究项目顺利实施本研究团队在蛋白质复合物动态变化的分子机制和功能研究方面有着非常扎实的研究基础，近5年来，项目组成员已经作为通讯作者/第一作者在Cell子刊上发表论文5篇，影响因子大于10分的有10篇，影响因子大于

13、5分的有30余篇。良好的工作条件和环境为本研究项目顺利完成提供了保障本项目依托、承担和参加研究单位（中国科学院上海生命科学研究院、中国科学院北京生物物理研究所和中国科学院北京遗传发育研究所等）都属于国内一流的科研院校，有很强的综合科研实力。并且大部分科研骨干都依托于多个国家级和省部级重点实验室，包括分子生物学国家重点实验室，这些国内一流的科研院校及所依托的国家级和省部级重点实验室为本项目的开展提供了良好的工作环境和条件。本项目依托、承担和参加研究单位装备了开展分子生物学、细胞生物学、免疫学、电生理、形态学和行为学方面研究的仪器设备，建立了成熟的实验方法，包括免疫荧光组织化学技术、激光共聚焦显微

14、镜术、包埋前/后免疫电镜技术、活细胞成像技术、流式细胞分析技术、分子原位杂交技术、酵母双杂交系统、免疫共沉淀技术、全细胞膜片嵌技术、动物模型制备、行为学分析以及蛋白质肽谱分析、转基因动物制备和基因敲除技术等。这些条件都确保了本项目在仪器设备和技术方法的需求方面切实可行。（四）创新点与特色脂质代谢是生命活动的重要事件，并与冠心病、脑中风、糖尿病、肥胖等重大疾病的发生密切相关。蛋白质是脂质代谢及其调控的主要执行者，认识脂质代谢关键蛋白质分子的生化特性及其相互作用将有助于解释脂质代谢调控的规律、阐明重大疾病的发病机制，为药物靶点的发现和药物开发提供实验基础和理论依据。本申请项目开展的脂质代谢关键蛋白

15、质的研究，有以下显著特点与创新点。第一、脂质代谢过程涉及许多重要的膜蛋白及其复合物。由于脂类分子高度疏水，其相当多的代谢步骤发生在细胞膜性结构内，有许多膜蛋白参与，膜蛋白复合物的功能调控精细并且极其重要，已成为国际前沿重点领域研究。但是，针对生命体膜性结构环境的特异性研究技术方法进展缓慢，因此，本申请项目中针对脂质代谢关键蛋白，特别是膜蛋白复合物的探索，既是当前研究的热点、又是难点。第二、脂质代谢过程中涉及很多蛋白质和小分子的相互作用。这些相互作用，不仅仅表现为酶与底物的关系，更为重要的是活性代谢小分子作为触发信号，引起细胞内的重要信号转导途径，对其自身或相关代谢进行反馈或前馈调控。本申请项目

16、的各个课题中，都将对小分子参与的重要调控事件开展研究。第三、对脂质代谢调控关键蛋白的研究，有很强的应用性。不仅由于脂质代谢与重要疾病发生密切相关，更是因为在对脂质代谢调控的研究过程中，可以揭示内源重要的调节小分子和信号通路，本项目中，基于对关键蛋白质的前沿研究，已经或即将开展活性小分子化合物的筛选，为我国人口与健康事业作出贡献。（五）课题设置课题设置思路：本项目拟从“脂质代谢关键蛋白质的功能与调控机制”这一关键科学问题出发，围绕脂质代谢调控的关键转录因子、脂质合成与吸收、脂质运输和贮存等过程，着眼于脂质代谢关键蛋白质复合物的组成和动态变化规律、重要信号转导途径、生理功能、病理作用和与之相互作用

17、的小分子化合物，研究脂质代谢关键蛋白质动态变化及其对脂质代谢的作用，揭示其与重大代谢性疾病（如动脉粥样硬化、冠心病、中风、糖尿病、肥胖等）发生发展的内在关系，揭示其在生命活动中的规律，为疾病的诊断和治疗及其药物靶点的开发提供实验基础和理论依据。因此，本项目拟设立三个课题：课题一，脂质代谢调控的关键转录因子；课题二，脂质合成与吸收的关键膜蛋白及其复合物；课题三，脂质运输和贮存密切相关的重要蛋白。课题一、脂质代谢调控的关键转录因子研究目标本项目将通过研究LXR、TR和SREBP在不同组织中和不同配体水平下与其它蛋白质的互相作用，阐明转录因子调控脂质代谢的时空性从而揭示转录功能的调控机制。本项目将从

18、分子、细胞、组织和动物水平，在体外和体内研究蛋白质相互作用，着重于研究蛋白质相互作用调控转录因子功能的分子机制。利用脂质代谢调控的关键转录因子作为靶点筛选出与代谢性疾病相关的天然小分子化合物并在动物模型上进一步研究预测其临床效果。研究内容1TR调控蛋白的鉴定与功能研究通过酵母双杂交，我们初步鉴定出了一些新的TR相互作用蛋白质，包括一些转录因子(比如forkheadboxO，B-celllymphoma6protein)和辅助因子(如：Sin3A-associatedprotein，ligand-dependentcorepressor，mixed-lineageleukaemia)。在本项目研

19、究中，我们将以GSTPull-down、Co-IP等方法对这些潜在的相互作用蛋白质因子进行鉴定和确认，并研究各结合蛋白的表达谱。对于那些辅助因子，我们还将分离纯化其所在的复合物，鉴定该复合物的各个组成。除了研究TR与其它转录因子之间可能存在的cross-talk之外，我们将侧重于研究那些能调控染色质重塑的辅助因子和或具有肝脏组织特异性或脂肪组织特异性表达的辅助因子，研究其生物学功能，阐明其对TR蛋白质功能的影响和有关脂肪酸代谢方面的调控机制。2脂肪和肝脏组织特异性的LXR和SREBP辅助因子的鉴定与功能研究由于缺少商业化的脂肪组织的酵母双杂交文库，我们将分别构建小鼠白色和褐色脂肪组织的酵母双杂

20、交文库,筛选脂肪组织特异的LXR和SREBP结合蛋白，特别是辅助因子包括辅激活蛋白和辅阻遏蛋白。同时我们将利用亲和层析的方法直接从小鼠肝脏组织和脂肪组织的核抽提物中分离LXR和SREBP结合蛋白。在确认感兴趣的LXR和SREBP辅助因子后，我们将再次利用以上两种方法发现和鉴定辅助因子复合物的各个组成蛋白，进一步揭示该辅助因子复合物是如何调控LXR和SREBP，配合LXR和SREBP来调节肝脏细胞和脂肪细胞的脂质代谢的。其中我们将侧重于研究那些有翻译后修饰功能的辅助因子或被翻译后修饰所调控的辅助因子，阐明甲基化，乙酰化，磷酸化，泛素化和苏素化这些翻译后修饰过程调控LXR和TR蛋白质功能的分子机制

21、。3亮氨酸缺乏时mTOR对SREBP-lc的功能调控为验证mTOR对GCN2依赖的脂肪合成的调节作用是必要的这一假设，在Gcn2-/-小鼠中我们将用雷帕霉素处理来阻断mTOR信号通路，看是否可以模拟在Gcn2+/+小鼠中亮氨酸缺乏引起的脂肪合成抑制。Gcn2-/-小鼠将用亮氨酸缺乏饮食喂养7天，在第4天时注射雷帕霉素(bid,0.5mg/kg),直持续注射到第7天。所有的评估脂肪合成和相关代谢指标将被详细检测。尤其是我们将观测脂肪肝是否消失或缓解，肝中TAG是否降低和脂肪合成基因是否被抑制。如果我们能够证明mTOR的确是参与介导GCN2依赖的脂肪合成的调控，我们将进一步检测mTOR的上下游蛋白

22、，如S6激酶(S6K)、真核细胞启动子4E结合蛋白(eIF4Ebindingprotein,eIF4EBP)和hVPs34的功能作用。4亮氨酸缺乏时LXRa/RXR对SREBPIc的功能调控LXRa/RXR是SREBP-lc的主要调控因子，我们将首先检测LXRa/RXR的表达和活性在亮氨酸缺乏饮食喂养的Gcn2+/+和Gcn2-/-小鼠肝中是否存在差异。LXRa/RXR的mRNA水平和蛋白水平将分别用qRT-PCR和westernblots的方法检验。为评估LXRa/RXR结合到SREBP-1c启动子上的能力，我们将应用Nakatani的方法，用percoll梯度离心纯化的肝细胞核提取物进行E

23、MSA(gelmobilityshiftassays)实验。如果在亮氨酸缺乏后Gcn2+/+小鼠中的LXRa和RXR两者或其一的表达被抑制，而在Gcn2-/-小鼠中没有出现，那么意味着它们或其一可能是介导GCN2对SREBP-1c的调节。但是，因为多不饱和脂肪酸和氧化固醇可以修饰LXRa/RXR异二聚体的形成或与SREBP-1c启动子结合的亲和性，所以，如果我们发现两种小鼠中仅是LXRa/RXR异二聚体的结合活性不同，则说明该变化可能是通过多不饱和脂肪酸和氧化固醇的变化来实现的。如果多不饱和脂肪酸组成和水平改变，那就意味着它是LXRa/RXR水平改变的主要原因。5.调控TR、LXR和SREBP

24、活性小分子的筛选及其作用机制在上述对脂肪酸代谢关键转录因子功能与作用机制的基础上，筛选调控脂肪酸代谢关键转录因子功能的天然活性小分子，寻找先导化合物。将3T3-L1脂肪前体细胞分化成脂肪细胞作为体外模型，采用竞争结合法和报告基因分析法筛选出小分子化合物，检测LXRa，TR，SREBP-1c以及靶基因FAS、SCD-1、ACC的基因表达，在细胞模型上首先论证筛选出的小分子化合物对脂肪合成信号转导通路的影响。采用高脂餐诱导建立肥胖动物模型或db/db糖尿病小鼠，在动物模型上证实小分子化合物对脂肪酸关键蛋白质合成及信号转导通路的影响和作用及预防和治疗代谢综合症的效果。承担单位：中科院上海生命科学研究

25、院课题负责人：秦莹，研究员，中科院上海生命科学研究院经费比例：30课题二、脂质合成与吸收的关键膜蛋白及其复合物研究目标阐明脂质合成与吸收的关键膜蛋白HMGCR、NPC1L1和ACAT等发挥功能的分子机制，鉴定上述膜蛋白复合物的关键组成因子，揭示其重要生物学功能及调控机制。探索这些重要蛋白质在胆固醇代谢调控、动脉粥样硬化及心脑血管疾病发生中的功能作用，筛选活性小分子化合物，为相关疾病的诊断、药物靶点的开发及先导化合物的发现提供直接基础。研究内容膜蛋白HMGCR降解复合物中蛋白质因子的鉴定与功能研究HMGCR是胆固醇合成途径中的限速酶，其蛋白质降解受反应下游产物甾醇反馈调控。我们前期研究结果已经揭

26、示Insig/gp78/VCP/Ufd1复合物介导了HMGCR蛋白降解，但该复合物中的其它蛋白因子尚未被完全发现，我们将利用酵母双杂交、免疫共沉淀技术结合大规模质谱鉴定等手段，系统地筛选与HMGCR及其复合物中Insig和gp78等结合的蛋白质，研究它们在HMGCR蛋白质降解以及胆固醇合成代谢中的生物学功能。脂质吸收关键膜蛋白NPC1L1的作用机制与结构基础NPC1L1是介导胆固醇吸收的关键蛋白，它含有1300多个氨基酸，序列预测含有多个跨膜结构域，其中的5个跨膜区段构成保守的“甾醇感受结构域”(SterolSensingDomain,SSD)。我们前期工作揭示甾醇促进Clathrin/AP2

27、介导的NPC1L1的内吞，揭示了NPC1L1介导胆固醇吸收的分子机制。为深入研究NPC1L1蛋白在胆固醇吸收过程中发挥作用重要结构基础，我们在这部分工作中将重点筛选鉴定NPC1L1蛋白结合胆固醇的位点以及鉴定其结合AP2复合物2亚基的Motif。NPC1L1膜蛋白复合物中新蛋白因子的鉴定与功能研究我们前期研究发现，胆固醇促进NPC1L1蛋白从细胞质膜向胞内小泡转运，它通过小泡内吞而将胆固醇大量运输进细胞。NPC1L1在其动态调控及行使功能过程中，涉及到和其它蛋白相互作用，形成复杂的膜蛋白复合物。我们在这部分研究内容中，将利用酵母双杂交以及免疫共沉淀结合质谱鉴定的方法，寻找鉴定NPC1L1膜蛋白

28、复合物中的未知蛋白因子，深入研究其中NPC1L1蛋白质转运以及胆固醇吸收过程中的生物学功能。胆固醇酯合成酶ACAT蛋白降解调控的分子机制及其作用ACAT是细胞内唯一催化胆固醇转变为胆固醇酯的酶，它对于维持胆固醇代谢平衡、减少胆固醇毒性以及在胆固醇吸收和脂蛋白装配中发挥了至关重要的作用。但是，ACAT基因的转录并不直接受胆固醇水平的调控。我们在前期探索中发现，胆固醇能够显著增加ACAT的蛋白量，推测胆固醇前馈提高ACAT的稳定性，并且发现Insig在ACAT的降解过程中发挥作用。我们将深入研究Insig/gp78/VCP/Ufdl复合物是否同时介导ACAT蛋白降解，鉴定ACAT的泛素化修饰位点，

29、揭示参与其降解调控的重要蛋白质，以及探索相应的调控机制及生物学意义。ACAT1不同异构体的功能与调控机制我们前期研究揭示ACAT-1基因定位于两条染色体上，由各自的启动子转录出两个前体RNA,通过反式和顺式剪接产生出多种成熟的mRNA,后者通过AUG和非AUG起始翻译分别编码50-kDa和56-kDaACAT蛋白。我们将深入研究不同形式的ACAT-1Isoform的膜拓扑结构、酶活性、聚集体形式以及对甾醇和脂肪酸的底物特异性。同时分析它们的组织细胞和不同生理病理条件的表达谱、亚细胞地位等，该工作将揭示ACAT-1不同Isoform在细胞内胆固醇和胆固醇酯之间的代谢平衡调控中的功能作用和调控机制

30、。调控脂质合成与吸收的活性小分子化合物的筛选及其作用机制我们将基于上述对于胆固醇代谢关键蛋白功能与作用机制的良好研究进展，设计构造可用以高通量化合物筛选的药靶系统，筛选调控胆固醇代谢关键蛋白质功能的小分子化合物，并对所获得的化合物进行优化改造，获得先导化合物。进而，利用该先导化合物，揭示其在胆固醇代谢调控及相关疾病（包括高胆固醇血症、动脉粥样硬化引起的心血管疾病）发生中的作用。这部分工作既提高前沿基础研究水平、也促进优化获得先导化合物和研发具有自主知识产权、针对胆固醇代谢紊乱疾病的新药。承担单位：中科院上海生命科学研究院课题负责人：宋保亮，研究员，中科院上海生命科学研究院经费比例：50课题三、

31、脂质贮存和运输密切相关的重要蛋白研究目标阐明Seipin调控脂滴成熟及脱离内质网过程的功能及分子机制，并揭示脂滴在脂类合成与运输过程中的作用及其调控机理，以及它与其它细胞器相互作用机理。阐明参与胆固醇运输与吸收的重要蛋白NPC1和NPC1L1功能的蛋白质分子基础。1Seipin在脂滴形成过程中的作用我们将利用基因敲除技术建立人类遗传性脂肪营养障碍的Seipin突变的果蝇模型，观察突变体中脂滴的发育、形成过程，并利用果蝇体系中丰富的遗传学手段寻找Seipin互作基因，研究它们是如何调控脂滴形成。我们还将从生物化学的角度利用免疫共沉淀技术结合蛋白质谱分析寻找Seipin的结合蛋白，同时研究这些结合

32、蛋白对脂滴形成以及人类遗传性脂肪营养障碍的影响。我们也将利用激光共聚焦实时成像技术辅以荧光标记的Seipin及脂滴从细胞生物学的角度研究脂滴的动态形成过程。2脂质合成关键酶在脂滴中的功能及其调控机制脂滴的蛋白组学及荧光蛋白的定位研究发现脂滴上不仅有脂质水解酶，同时还有参与脂质合成的关键酶，这个发现显示脂滴可能具有脂质合成功能，为鉴定这个可能性，我们已成功地建立了脂滴invitro脂质合成方法。我们用纯化的脂滴，在ATP和CoA存在的条件下，与放射性标记的脂肪酸相互作用。反应完成后，将脂滴再纯化，然后分析脂滴的放射性标记的脂质。这个实验主要用于检测脂滴上Acyl-CoAligase和Acyl-C

33、oAtransferase活性。为了区分这两种酶的调控，我们还可以测定反应中间产物，即放射标记的Acyl-CoA，以反映ligase活性。同时我们还将细胞质加入反应，以寻找细胞质中调控这两个酶的活性因子。若细胞质确有调控这两个酶的活性因子，我们将用FPLC和HPLC进一步分离纯化这个活性因子。而后，我们将深入研究这个活性因子调控Acyl-CoAligase和Acyl-CoAtransferase的分子机制，为寻找脂滴上这两个酶的结合位点及深入探讨它们的活性调控分子机理，我们还将用脂滴蛋白进行这两个酶的免疫共沉淀，然后用质谱分析以确定这两个酶分别在脂滴上的结合蛋白。RNAi方法将用于检验其中哪个

34、蛋白是确定这两个酶在脂滴上定位的蛋白。基因突变技术及转基因技术将用于寻找脂滴定位蛋白与之相结合的酶的结合位点。3Rab18调控脂滴与内质网的相互作用脂滴有可能参与细胞内脂质运输的假说基本建立在脂滴表面上被发现具有一系列膜转运蛋白，尤其是一组小G蛋白，Rabs。其中Rabl8近来进一步被揭示调控脂滴与内质网的相互结合。由于内质网是细胞内最主要的脂质合成及代谢的细胞器，所以脂滴与之的相互作用将是脂滴的形成及脂质运输的关键步骤。为此，我们将以Rabl8为基点，进一步深入探讨脂滴与内质网相互作用的分子机制。首先我们将从纯化的脂滴上获得脂滴蛋白，然后用Rabl8抗体进行免疫共沉淀，再用质谱蛋白分析技术以

35、确定Rabl8在脂滴上的结合蛋白。并辅果蝇体系的遗传筛选技术研究Rab18的互作蛋白。从这些蛋白中找到Rab18的作用蛋白，用基因突变技术及RNAi方法检测该蛋白在脂滴与内质网相互作用中的功能。在寻找Rab18在脂滴上的作用蛋白中，我们将用GTP-Rab18(Q67L)和GDP-Rab18(S22N)相互比较，选用GTP-Rab18专一结合蛋白。分析脂滴与内质网的相互作用将利用我们已建立的invitro脂滴与endosome相互作用方法。4NSF和aSNAP参与脂滴和内质网半融合的功能我们用蛋白组学研究发现的NSF和a-SNAP预示了脂滴有可能参与膜融合过程。去年发表的有关SNARE的脂滴融合

36、的文章证实了这一假想。但脂滴是否与其它细胞器融合仍然有待进一步证实。由于内质网与脂滴的相互作用最具生理意义且已被许多实验证实，所以我们选用这两个细胞器来研究它们的融合过程及调控。因为脂滴只具有单层磷酸膜，所以脂滴的全融合只相当于其它细胞器的半融合(hemifusion)。按传统的膜融合观念，我们仍假说这种融合为半融合。我们同时还假设脂滴是通过这种半融合来传递脂质的。我们将用自身抑制(self-quenching)浓度的Rh-PE标记纯化的脂滴，将其与纯化的内质相互作用，用GTP-Rab18,GDP-Rab1&RabGDP,GTP,GDP以及ATP来调控这个反应。两细胞器的半融合将由Rh-PE浓

37、度稀释而产生的荧光来测定。ATP和NEM将用于分析NSF的作用，a-SNAP的作用蛋白将由脂滴蛋白免疫共沉淀加质谱蛋白分析来确定。胆固醇运输关键膜蛋白NPC1和胆固醇吸收关键膜蛋白NPC1L1功能差异的分子机理我们将用不同细胞系对NPC1及NPC1L1这两个高度同源但功能不同的膜蛋白进行结构域嵌合分析，以发掘有关决定NPC1及NPC1L1蛋白质定位及参与胆固醇运输与吸收所需的结构域，并进行结构域相关分子机制探讨。同时我们也将利用NPC1及NPC1L1突变体果蝇模型验证细胞系的实验结果，并进一步探索胆固醇运输的分子机制。承担单位：中科院北京生物物理研究所课题负责人：刘平生，研究员，中科院北京生物

38、物理研究所经费比例：20（六）各课题间的有机联系以及与项目总体目标的关系本项目包含的三个课题的设置相互间紧密相关，围绕脂质的合成与吸收、运输与贮存等代谢途径，从脂质代谢的直接执行蛋白和关键转录因子等多个层面开展研究，各个课题相互关联和逐渐延续形成一个完整的研究体系。课题一由研究脂质代谢关键转录因子的3个实验室承担；课题二由从事脂质合成与吸收、有机化学合成、药物筛选以及临床研究共5个实验室联合承担；课题三由从事脂质贮存与运输的2个实验室承担。首先，脂质代谢相关基因的表达受LXR、TR和SREBP等转录因子的调控，该类转录因子及其复合物的功能（课题一）和对脂质代谢各个途径（包括脂质合成与吸收、运输

39、和贮存等）（课题二、三）的调控作用将被研究。脂质合成与吸收（课题二）是人体获取脂类分子的两个途径，获取的脂质将在胞内运输并贮存（课题三），并且其中的代谢活性小分子会直接作用于关键转录因子包括LXR、SREBP等（课题一）。脂滴是胞内脂质贮存的主要细胞器（课题三），同时，脂滴也参与了脂质的合成（课题二）。课题二中的科研队伍同时为三个课题提供临床病理样本、高通量化合物筛选、以及小分子化合物的合成改造等方面合作。因此，在本申请项目各个课题的研究内容均围绕项目的总体目标，针对脂质代谢的不同重要方面，相互独立，又紧密联系。四、年度计划硏究内容预期目标第年详细分析脂质代谢关键蛋白质的功能与结构基础，揭示其

40、发挥作用的分子机制和调控途径。构建脂质代谢关键蛋白质的各种突变体，结合过表达、RNAi或基因敲除等实验手段，详细分析脂质代谢关键蛋白质的生物学功能，包括对脂质合成、吸收、贮存和运输等多个方面的影响。揭示关键蛋白质发挥作用的结构基础，阐明重要结构域的功能。在细胞和动物个体水平分析其对脂质代谢的作用，并在不冋脂质代谢条件下，分析蛋白质的相互作用、修饰、亚细胞定位等，揭示重要的调控途径。获得多种脂质代谢关键蛋白质功能异常的细胞株和动物模型等研究系统，发现关键蛋白质与脂质代谢各个水平的密切关系，阐明其相互作用、修饰、亚细胞定位等，揭示重要的调控途径。建立脂质代谢关键蛋白质的功能与结构域之间的关系，揭示其发挥作用的结构基础和分子机制。第年系统地分析和研究脂质代谢关键蛋白质复合物动态变化过程中的蛋白质相互作用网络，鉴定新的相互作用蛋白。利用酵母双杂交、GSTpull-down和免疫共沉淀技术结合质谱鉴定等方法，重点研究脂质代谢调控的关键转录因子蛋白复合物（LXR、TR、SREBP）、脂质合成与吸收的关键膜蛋白复合物（gp78、NPC1L1、ACAT）、脂质贮存与运输密切相关的蛋白复合物（Seipin、Acyl-CoA