毛蚶组织切片的制作和观察

1、毛蚶组织切片的制作和观察HE染色法，是使用切片机把组织结构切成片层。选取的组织，经过固定、脱水、切片、染色等程序，然后，经过物理、化 学的处理。在进行操作时，要注意根据不同性质的材料，选择相 对比较合理的方法进行处理。 是生物学和组织学广泛应用的染色 法。切片法，能保障细胞与细胞在切片过程中，保持正常的组织 关系，更好地保护组织细胞的原貌不被损坏， 是光学显微镜的主 要制片方法。1 实验材料及方法实验材料 95%乙醇、中性树胶、固体石蜡、氨水、鸡蛋、甘油、冰醋 酸、甲醛、盐酸羟胺、苏木素、伊红、钾明矾、活鱼、苦味酸、 水合氯醛、 碘酸钠、明矾、柠檬酸、肝素钠、毛蚶（在市场购得） 。实验仪器及设

2、备苏木素伊红（HE染色试剂盒、载玻片、盖玻片、玻璃棒、 瑞氏吉姆萨复合染液试剂盒、毛笔两支、镊子 2 个、电炉 1 个、 洗衣粉、500 mL烧杯6个、染色缸20个、染色架5个、1 mL注 射器 2 个、 5 mL 注射器 2 个、 1 000 mL 烧杯 2 个。实验所需试液的配制1.3.1福尔马林溶液 甲醛10 mL蒸馏水90 mL，配500 mL。苏木素 1 染液配制 蒸馏水 1 000 mL 将碘酸钠 0.2g加热到100 C后加入苏木精1 g,呈樱桃红色，然后加入硫酸 铝钾 50 g ，使其变成蓝紫色，继续加温煮沸5 min 后，加入 50g 水合氯醛继续搅拌，此时溶液应该为红紫色，

3、溶解完后加 1 g 柠檬酸，然后取下冷却，此液可长期保存。若陈液水分蒸发可加 适量 2%钾矾液稀释 2 。1%的伊红溶液 称取伊红1 g，力口 100 mL蒸馏水溶解， 用时加 3 滴冰醋酸。70%， 80%， 90%酒精溶液 用无水乙醇分别与水比例为70 : 30、80 : 20、90 : 10配制相应浓度的酒精溶液。实验操作溶液配制 配制福尔马林溶液，苏木素染液，1%的伊红溶液， 70%、 80%、 90%酒精溶液待用。1.4.2制作血涂片 用5 mL注射器在鲫鱼尾静脉采取血液 1 mL再吸取2 mL肝素钠抗凝血。在载玻片的一端滴一滴血液标 本，推片与载玻片呈3045夹角，从血滴前端接触血

4、液并使 血滴沿着推片均匀地散开， 使血滴形成薄薄的一层血膜， 然后在 阴凉处风干。然后再做四个血涂片，其中第一个做空白对照，两 个用瑞士染液染色， 两个用吉姆萨染液染色。 风干后清洗再晾干， 最后在显微镜下观察血细胞结构特点。切片制作玻片处理 在烧杯中加入适量水与洗衣粉，将新载 玻片置于烧杯中，加热煮沸 1520 min，小水流冲24 h，滤纸擦净后使用取材 尽量取最新鲜组织，如有污物用水洗干净然 后滤纸吸干。一旦组织离开鱼体， 组织会以惊人的速度迅速固定， 所以取新鲜组织来保证组织原本的形态学结构。组织块大小：斯顿伯格 L.A 指出，切片厚度的轻微变化，对 组织化学定量结果的重复性产生极大的

5、影响 3 。目前已有的确 定组织切片厚度的方法， 多以切片机标记的切片厚度作为切片的 真实厚度； 或者测量组织块在切片过程中变薄的变化， 推算组织 切片的平均厚度4。所取组织体积1.0 cm x 1.0 cm x 0.3 cm , 以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部 5 。取材部位： 切片一定要把组织的结构特点全部显示出来，材料的选取是关键。 取材必须避免人为改变组织形态， 取材刀剪锋 利，夹取时不要挤压组织，组织固定以后，容易收缩，要将组织 展平，从而显示组织完整结构。 取材对石蜡组织切片制作至关重 要，把握好取材， 也就成功了一半。 取材部位为鳃、 肝脏、 肾脏、 脾脏、肠。固定与清洗

6、取不同组织，两组用代表，分别 置于纱布中包好，在固定液中固定 24 h 以上，然后取出各组织 进行修块，修块大小为1 cmx 1 cmx 0.5 cm，修块后再固定6 7 h 。将之前固定好的组织纱布块再放于大烧杯中，在烧杯口上 盖上纱布，并使烧杯略微倾斜，用小水流自来水冲洗 24 h 。将组织放于固定液中， 目的是防止细菌繁殖和酶作用使组织 腐败或自溶，使组织和细胞的固有形态、结构得以保存 6 。清 洗的目的是洗掉固定液， 同时冲洗也可以改变组织硬度， 使切片 制作变得简单和更易于组织结构的观察与分析。脱水与透明 将组织分别移入 70%酒精， 80%酒精， 90%酉精，95%酉精中，各个浸泡

7、12 h，然后100%酒精各浸 泡2 h,蘸干后再浸泡于无水酒精和二甲苯1 ：1混合液10 min,二甲苯各20 min，使二甲苯将酒精替换出来。浸蜡 提前8 h将石蜡放入60 C烘箱融化，反复 两次再用。在60 C烘箱中浸蜡，否则脆，浸蜡 3 h。包埋 把牛皮纸做成小纸盒并在小纸盒底部标注组 织名称， 先将熔好的蜡倒入小纸盒中， 再把浸蜡后的组织分别至 于小纸盒中， 石蜡凝固后组织被抱在其中， 包埋后的组织可长久 保存。143.7 切片 视组织的大小，在靠近组织约0.10.2 cm的地方切掉多余的蜡， 不然可能会容易使组织褶皱不平； 把修好 的蜡块放置在金属持蜡器上；把切片刀安装在切片机的刀

8、台上， 把刀台上的紧固螺丝适当拧紧， 使切片时比较稳定， 从而能使切 片厚度误差减小；一般情况下石蜡切片的厚度保持在46卩m；用镊子小心地将切好的蜡带轻轻平铺在42 C的水面上，借水的温度和张力， 将略皱的蜡带自然展平；待到切片在恒温水面上充分展开后， 将蜡片捞到载玻片的中间，然后倾斜载玻片使载玻片上的余水流失，再置于 6065 C烘箱内恒温烤片3 h，使熔化在组织间隙的石蜡完全脱去，从而组织与玻片紧密结合。1.4.3.8 染色和封片 7烘箱中取出的玻片先于二甲苯中各 10 min ，擦干后再 移入酒精 100%， 95%，90%，80%， 70%各 2 min ，蒸馏水 2 min ， 然后

9、移入苏木素中染色 89 min，取出擦干，在盐酸酒精中放 下去 1秒然后拿出，反复 3次，再用自来水小水流冲 20 min 。冲洗后于伊红中染色 710 min，再分别于70% 80% 90% 酒精中各洗3次，擦干后于95%酉精，100%酉精各5 min, 二甲苯各10 min，最后用中性树胶封片，12 d后显微镜 观察照相。2 结果与分析2.1 染色结果毛蚶心脏血细胞染色情况（图 1 ）：细胞膜显示为淡红色， 可以明显地看出细胞核结构。染色不明显。毛蚶血液中，含有淋 巴样细胞、巨噬细胞、白细胞和嗜碱性细胞等图 1 毛蚶血涂片（瑞氏染色）外套膜染色切片（图 2），染色较为明显，颜色为红色。可

10、以明显地看出分层结构。 组织分为两层， 外面一层膜状结构为淡 黑色，规范地包围着内部结构，起着很好的保护作用，内部呈现 明显的条纹状、区分明显。但是由于切片时不太规范，导致切片 不太完整，所以看到的图片也不完整，中间出现明显的断裂。图 2 毛蚶外套膜肌肉组织 40 倍图3 毛蚶肠组织组织 10倍毛蚶肠组织的内表面形成皱襞， 皱襞上含小肠绒毛， 增加了 消化食物、吸收营养的表面积。肠道染色不太明显，但是可以看 到明显的组织结构。结构分明显的两层，外面一层壁状结构，包 围着内部的触角状的结构，颜色淡红。总结分析总体来说，本次实验还算是成功的， 因为染色结果比较明显， 毛蚶的组织结构区分、染色明显。但是具