任务五高效液相色谱仪的使用详解课件

1、仪器分析生物工程系第1页，共34页。任务五 高效液相色谱仪的使用第2页，共34页。了解高效液相色谱法的主要特点及其适用范围了解高效液相色谱仪的构造 掌握高效液相色谱法的使用技术和定量方法 学 习 目 标第3页，共34页。一、 概 述 高效液相色谱法（HPLC）：以气相色谱为基础，在经典液相色谱（LC）实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。（一）HPLC的特点（二）与经典LC相比HPLC的优点（三）HPLC的适用范围第4页，共34页。 高压压力可达150 300kg/m2； 高速流速为0.110.0mL/min； 高效柱效高，在一根柱中同时分离成分可达100种； 高灵敏度紫外检测器可达0.01n

2、g，荧光和电化学检测器可达0.1pg。（一）HPLC的特点第5页，共34页。（二）与经典LC相比HPLC的优点 速度快通常1530min一个样，某些样品5min可完成； 分辨率高可选择固定相和流动相达到最佳分离效果； 灵敏度高紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg； 柱子可反复使用用一根色谱柱可分离不同的化合物；样品量少，容易回收样品经过色谱柱后不被破坏。第6页，共34页。（三）HPLC的适用范围 适合分析高沸点、热不稳定、离子型的样品 ； 应用范围广泛，适用于医药、环保、石化、生命科学、食品工业、农业等多个领域； 在已知的化合物中能用液相色谱分析的可占7080%。第7页

3、，共34页。一二、 结 构第8页，共34页。（一）工作流程高压输液系统 色谱柱系统（数据记录处理系统）工作站 检测系统进样系统动画第9页，共34页。（二）工作系统1、 高压输液系统主要部件：贮液器、过滤器、高压输液泵、梯度淋洗装置第10页，共34页。（二）工作系统2、进样系统 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置。动画第11页，共34页。（二）工作系统3、色谱柱系统 柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。第12页，共34页。（二）工作系统4、检测器系统 紫外检测器 荧光检测器 示差折光检测器光电二极管阵列检测器第13页

4、，共34页。（二）工作系统5、色谱工作站 以VI2010色谱工作站（软件操作示范）为例：此工作站适用范围广，支持多个检测器：可与任何气相色谱仪、液相色谱仪或带电压输出的电子设备连接，可同时采集一到两个独立检测器信号。 第14页，共34页。三、 使 用 技 术准 备 清洗、关机冲洗柱子冲洗管路关主机关电脑关电源开机、进样流动相标液样液柱子选择仪器检查开电脑、主机、工作站参数设置方法建立进样操 作 步 骤第15页，共34页。1、准备所需的流动相，用合适的0.45m滤膜过滤，超声脱气20min。2、根据待检样品的需要更换合适的色谱柱。3、准备样品和标准溶液，用合适的0.45m滤膜过滤。4、检查仪器各

5、部件的电源线、数据线、输液管道是否连接正常。准 备第16页，共34页。 接通电源，依次开启不间断电源、真空脱气机、多元泵、检测器。待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器，主机、最后打开色谱工作站。1、参数设定：波长、流速、流动相比例、梯度。2、更换流动相并排气泡。3、平衡系统：流动相冲洗系统、检查管路是否漏液、观察压力值变化、观察基线变化。4、进样：自动进样、手动进样。开机、进样第17页，共34页。1、分析结束，数据处理、打印报告。2、关闭柱温箱和检测器，然后再用经过滤和脱气的适当溶剂冲洗色谱系统。3、冲洗完毕后，逐步降低流速至0，关泵。4、关闭液相装置，作好使用登记，内容包括日期、检品、色谱

6、柱、流动相、柱压、使用小时数、仪器完好状态等。清洗、关机第18页，共34页。四、 数 据 分 析（一）谱图判断（二）结果分析第19页，共34页。（一）谱图判断 分离度一般应1.5； 重复性两次谱图的峰面积应相差不超过1%； 理论塔板数应规定的理论塔板数目； 拖尾因子0.95T1.05； 保留时间对照与样品的主成分保留时间应大致一致。第20页，共34页。（二）结果分析1、定性方法 利用已知标准品定性 利用检测器的选择性定性 利用紫外检测器全波长扫描功能定性2、定量方法 归一化法 外标法 内标法第21页，共34页。 课后思考题1、外标法定量与内标法定量有何差别？2、流动相在使用前为何要经过脱气处理

7、？第22页，共34页。实训六 高效液相色谱仪的使用一、 实训目的二、 实训原理 三、 实训材料四、 实训步骤五、 结果分析六、 注意事项第23页，共34页。一、实 训 目 的1、了解高效液相色谱仪的构造及工作原理；2、掌握高效液相色谱仪的使用方法；3、学会用单点外标法进行数据处理和结果分析。第24页，共34页。二、实 训 原 理 利用试样中各组分在色谱柱中的淋洗液和固定相间的分配系数不同，当试样随流动相进入色谱柱中后，组分就在两相间进行反复多次分配，由于固定相对各种组分的吸附能力不同，因此各组分在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，顺序进入色谱柱，产生的离子流信号经放大，在

8、记录器上描绘出各组分的色谱峰。第25页，共34页。三、实 训 材 料1、主要仪器设备：Agilent高效液相色谱仪，Hypersil ODS-C18柱（5m，4.6*100mm），MWD检测器，超声波清洗器，膜过滤装置。2、主要试剂：甲醇（色谱纯），0.02mol/L乙酸铵溶液，25g/mL苯甲酸标准溶液。3、样品测试溶液：市售碳酸饮料。所用溶液均经过0.45m膜过滤。第26页，共34页。四、实 训 步 骤1、取市售碳酸饮料约10mL于50mL烧杯中，超声脱气30min后，准确吸取1mL，经滤膜过滤至10mL比色管，以经滤膜过滤的高纯水定容至5mL。2、色谱条件：柱温25；检测波长230nm；

9、 进样量20L；流速1.0mL/min； 流动相 甲醇：乙酸铵溶液=5:95第27页，共34页。四、实 训 步 骤3、开机，打开色谱工作站。4、打开脱气阀，以5mL/min流速对流动相进行脱气。5、脱气完毕后，调节流动相流量为1.0mL/min，切换脱气阀，打开柱温控制开关，打开UV检测器开关。按色谱条件设置相应参数。6、建立方法和进样序列。第28页，共34页。四、实 训 步 骤7、待基线平稳后，调用方法和序列，开始测样。 8、测样结束，打印图谱报告。9、关闭检测器和柱温箱，清洗色谱柱及管路，以1.0mL/min的流速，先以水清洗色谱柱20min，再以甲醇清洗色谱柱30min。10、关闭色谱工

10、作站、关机，作好使用记录。第29页，共34页。五、结 果 分 析1、定性分析 以保留时间定性，填写下列表格。标准样品名称苯甲酸保留时间（min）标准图谱中标准样品浓度（g/mL）25.0判断样品中有无苯甲酸（打勾）A 有 B 无第30页，共34页。五、结 果 分 析2、定量分析 以峰面积定量，根据公式计算样品中苯甲酸的含量。 W样品中苯甲酸的含量， g/mL； A样品中被测物质的峰面积； As标准样品中被测物质的峰面积； C标准样品的浓度， g/mL； V2样液定容体积，mL； V1所取样液体积。第31页，共34页。六、注 意 事 项1、流动相必须使用色谱纯试剂，使用前用0.45m膜或更细的膜

11、过滤，并超声脱气，恢复到室温后使用。2、不能用纯乙腈作流动相，防止单向阀粘住导致泵不进液。3、长时间不用仪器，应将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存，应该用有机相（如甲醇等）保存。4、C18柱绝对不能进蛋白样品、血样、生物样品。第32页，共34页。六、注 意 事 项5、注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。6、更换流动相时，应先将吸滤头部分放入烧杯中，边振动边清洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶相的流动相时要用异丙醇过滤一下。7、气泡会致使压力不稳，重现性差，在使用过程中尽量避免产生气泡。第33页，共34页。实训技能考核标准项目考核内容考核重点分值比例高效液相色谱仪的使用样品处理样品移取 吸量管的正确使用；达到熟练程度5%脱气处理及定容 超声波仪的正确使用能够精密移取