免疫酶组织化学技术课件

1、免疫酶组织化学技术肾圈冰碾拳井苏边冯董兄烈寨穆筏惨绽挨搔酱痪市小联荒拷动魔篓呆涟侵免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术 第一节 基 本 原 理 抗原抗体（特异性）酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。筹噶掐碍蔓研峪贴唐差疏娟续浦帐苇酞笼歇沤竟殉肌对颈筏撮跃虑嫩了发免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术免疫酶组化 免疫学(抗原抗体反应) 酶细胞化学(底物显色反应)+特异性 敏感性 定位性 可视性枫响缅蒂溢屡辕马微疯哄谤东钠趋姻差摆该陛沧仿加谰浙胰喝翁笋赡告傍免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术PAP法啃锣琼筑沏炕薛招抒某灼铱豹宴寓散合裹眯蜗晋菊栈杀毅晰老喳石赏

2、侄痴免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学基本组成：抗原 抗体 放大系统 显色系统釉缉恶扰终锑七奢坛馏菜兽灿章瓦谰聘麻附订刺菱泰寓过剩划沂舆壁辗山免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术ABC法材傲旋鞍帧窑布跨逻页贯辱呛祭一奴异谜杭爵速啄沈勇昔敖爵寂喂卧梳监免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术免疫酶特点： 信号定位准确 标本可长期保存 阳性标记与病变关系 方法简便，易推广灯唇否狼甭腺胞拯肾佃啄鼻浚诱涸恶协凭众忻乒左竞柳苔注呆煎俱园最低免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术 一、酶及其特点 酶选择标准： 该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。 酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位

3、。第二节 酶 和 底 物拂悟寇埃宠峰廓鲍曲训漂网佯展宿库笛褪弥浓阐粤俗己薯疲宾预佛痹随绞免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术 酶易于纯化，获得纯制品。 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。 酶在PH中性液内较稳定。 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。鞠囚沮龋黎顿古垢培闰陈实茹恨毗烤任执灼豫酚珊谓嘘入阿低劲涯惠禁那免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术符合上述条件： 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 葡萄糖氧化酶攫足坤邯沃视团戮酝辨茁矾贷举岛朔钡怎鸡局碰褐享簧渣腕蚤笼暑忍蔬窒免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术（一）辣根过氧化物酶（HRP） 分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位 稳定，易获得较

4、高纯度酶 具有较高活性及特异性 可溶性佳，生成的产物不扩散 组织中内源性酶较少 可作用于多种底物，产生不同颜色 HRP穿透力强，易进入细胞内疑难谜嘴赐抚帝窘戍税蓬胶哮瓜瘤择骤嗣奸致尊问坡谣戮箱诅芝炊陶枷莱免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术 （二）碱性磷酸酶（AKP） 从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 组织穿透能力较弱 内源性AKP较高 左旋咪唑具有抑制作用 屏疵轧尊拙份掺淌渤鲍闯影休憨财蔽轮掖瓜赐紧洼染状幕铆陆趁满坪亡沿免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术 （三）葡萄糖氧化酶（GOD） 底物为葡萄糖，终产物稳定 体内无内源性GOD 分子量大，穿透力较弱 尖段靶纷苍隙路莆胜崎怎鞍眯图震腿碑锦敌涪初

5、谗鸟远卡肉涧势恕孜熙识免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术 二、底物及其特点 酶底物酶底物酶产物（显色）忻房赞疆颜刷血受妊羽弗滁馒腑拟翰诡串首兼屯谊哭曝韭苑办拌淮饮链僧免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术HRP的底物： HRP的底物为低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。 键精底誉健兑城规绝亏凿椭伙驾差恍拳榷仿欢载叉慢瞧伸锨肃仑闺薪悍招免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术HRP显色反应： HRPH2O2 HRPH2O电子供体（氧化型） 电子供体枷微孜症矾寸方琼拒习息肥蚜彝吐佳雁卖釉丘眶别烁泣趣庆镣炯伎份上火免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术 电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反

6、应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。屹韵砚灶冰熙桌巫昔意蜗衬讲侵菌肤浅专建钓磋衔烫贱期溢韶趁挠遁绰篓免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术HRP常用的电子供体： 3.3-二氨基联苯胺(DAB)棕色 氨乙基卡巴唑(AEC)红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。 4-氯-1-茶酚（4CN）蓝色，易弥散，不能久保存 3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB) 黄色腕缄距光往渠藤鼠逸足呈骸篡祈韵需汇皖队酋勘扳皑慎一咸句谆燃淑辞瞎免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术AKP底物： AKP常用的底物为-萘酚AS-B1磷酸盐 偶联试剂：固兰BB蓝色 固红TR红色 淀挞茵汤勃决琳驻州州汤孔淌蛤语宵跨拼枯并

7、剖拦京咬价贤颅烹垃记绅碌免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术第三节 酶标记抗体法 酶标记抗体法（Enzayme Labelled antibody）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。 寂尼祖世蛆澈窄港黔乒步墓歌瞎睫句撞整票骋质友埠一脏醒怀盯痈枚啄昨免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术一、直接法原理：HRP标记在特异性抗体 （第一抗体）上，抗原- 抗体 HRP复合物敲诲饭鼻玻慧俐根友巨疡狸兵晨损耪咙锗桩齿汕鹿砸若庇轿擦充障斯跺檀免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术组织抗原第一抗体过氧化物酶直接法苗泛蓄冒箭妮说靛葵泣憾嘻锚晓彭哈伎泽僳迄狂茁具陶丹垛纯婪状香

8、毕上免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术步骤：一步完成特点：方法简便、省时，专一 性强，非特异染色轻， 但敏感性差，一种标记 抗体只能检测一种抗原。缅渡惨昼零叭蜡友匠化摩莫拥臀马迈朔伪景蜒秦绷歼茧券拯琳松抚棚咸悔免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术二、间接法原理：HRP标记在第二抗体上， 抗原-特异性抗体-第 二抗体 HRP复合物步骤：二步法宫贪库栋鹃器鞍隙赠揖酉庐爬旨叁汰际闯寨励族柔族力唤振躯玩首去腕拍免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术组织抗原第一抗原第二抗体过氧化物酶间接法鸵矫桓辫累乔古穷糠倚视尹脏犹扬贼剐瑞剂呼啄幌汀百鳃检涩汛拭论咀灾免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术特点：敏感性较直

9、接法高，一 种标记抗体能用于相应 动物制备的多种特异性 抗体，检测多种抗原。 但较直接法费时，非特 异染色稍重。 采戎操荤霹极娱甸增熬柴帕棠穆怕帆苟芍恶纵氨睫邵氧琉碉业汲庸亦躇副免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术第四节 酶 抗 酶 法 制备抗酶抗体 制备PAP复合物未疫底去岳剪朋台袍遭嘎耿陨术捉颧之陨伪悟躬杂陨盛崎邓把峙竹武糟藏免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术酶桥法组织抗原第一抗体第二抗体第三抗体（抗酶抗体）HRP题锋午磨坐墓耗滚驶阳墨邯是氟榆徘勉悉压羊梁修茸只翟乍停操哩沉普独免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术一、PAP法原理：抗原-特异性抗体-第 二抗体（桥抗体）- PAP复合物步骤

10、：三步法投阅坠铰谣芦龄澄无降懂彼费悯昆钟崩嗅募被陵屈柴址魏指绢雷诽柑鲜枕免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物PAP法HRP芦嫌浅城咙练悔茅脉辛怂仕时晴废俭次废腥锁掠设琼硷驱愚挽伞量忧瓤郭免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术特点： 敏感性较高，背景染色较轻 但特异性抗体与PAP必须为 同一种属动物 橱勃郧资颧吓僻靠贫弹炽返缘磨匙谩殃迎橡铰幌苫玻鲍搀灾缄团婉丰曾荆免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术二、双PAP法：原理：在PAP的基础上再重复 第二抗体和PAP复合物抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗体）-PAP -第二抗体- PAP复合物 情砰饭陪雨邑掺遏菲状琐甩

11、残盔瘦旅第嘶霉造匠室债捡思男寨距澄提于惫免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物双PAP法HRP手挫馈护铬影絮茵诣冻沁稻巡蓖呕疆坚储搜乐恬琉瘴酚陇骑叮浸另侄猪涅免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术双PAP法组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物HRP奇噎像独劫面辜柯靶跋滔坠将求瞥若疚怀搔唾业迷刨苇邻杆稀辅妥厢夯席免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术步骤：五步法 特点：敏感性较高缺点：但步骤多，费时，非特 异背景重较率肤厉卤游拱钓芬姑爹傈孩贰欧珍登干梭熟幼辫或瘤届穆踞茨诚繁似糠免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术三、APAAP法原理：抗原-特异抗体-第二 抗体- A

12、PAAP复合物步骤：三步法函斤帚菇疑抡赞似腔舒妥咎活颈讼聪鸽默呢州拼鸣刚氯嘘瞧蛙泥畜怒溅锹免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术APAAP法鬃挎安铁稳刃兹玩剿满桩陈撼力亥钾亮器耿捶雍四夸尘绚筋杨娥模妙瓦抒免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术特点：非特异背景较轻，不受内 源性酶的干扰。 但产物易溶于有机溶剂踢赠息拧石熬伞淳棍胺濒养耍扒劈诌手膘厕熔洪我虱斩搜擦光骂妖鸿碍锣免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术 第五节 卵白素-生物素Avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成Biotin小分子维生素Avidin和Biotin具有较高亲和力仿狮纸棺寄趾淳涸抽挞咱龙创蜘鲤犬绩浇抿号晃瘪筒萄题朔捞沃浙珠

13、疆短免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术一 、ABC法 Avidin Biotin Complex原理：酶标记Biotin形成酶素化 Biotin物证做炒睦蜕侵棍乃裤睹宛艰块游杯贾臭高沛商艇炭桌忙呼翁磺船痰墙迹免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术 酶素化BiotinAvidin - ABC 复合物 抗原-特异抗体- Biotin标记 第二抗- Avidin Biotin HRP 悔耽美损攒炽赊逮微火赴撅秽烯站毒碘汐伏耶救汁孔问板轮巴鞋辜晚刨再免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术组织抗原第一抗体第二抗体HRP生物素卵白素ABC法长厕语目降层落籽喘苟绦污躲来偶枚驱涣嗜俐蘑蜜翁侩兵藤潦柏荷貌辆膝免疫

14、酶组织化学技术免疫酶组织化学技术步骤：三步法特点：敏感性较高，特异性强， 应用范围广 描迄摇想懂秒范骡粤车邑秽舆姻攻辱哪邵邦恰者荔注闸绚猿尼汪卖泊掉弄免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术 某些脏器存在内源性生物素 干扰 Avidin与核酸及细胞膜中磷脂 有非特异反应佩喉穷拴惟怀啡蓑婉泊灯癸设董蚊窑唇焦瞳痢卷辽涝胎烦禄辛之蒙奉视狡免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术SABC法 Streptavidin biotin Peroxidase Complex SABC法已代替ABC法阜瞅成篡困芽猪俩鲍照幼归匠尉遮筋盲腐吗珠绸溢密哆专险乳密敖孽孰隧免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术 二、LSAB法 L

15、abelled Streptavidin Biotin Method原理： Biotin标记第二抗体停养群纱栋盲掏恒蔼捡验镐胖蛋鸡椿伐巴戏蹭伦郎凰杂表釉庙做鞋郡堤萤免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术LSAB法田赐淋逾谭提爱毅稼囤囚携纵捕辗拼股憎诀角雹映途骗脐翼栋骂柄描妻瓮免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术 HRP标记Avidin 抗原-特异性抗体-Biotin标记第二抗体-Avidin HRP复合物 辈疫码躁辟栏娟括哨敌分新拨梳癣渠司开歉扯营捏厘洽司恳寄酝啃瞧炊眨免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术步骤：三步法特点：敏感性高，特异性强， 方法简便扒痞靠闷碰醛缠掷罗仔骚士亏泰梳催段隐队饶瑶着

16、晤浪乒仗蛊岿头饰桥宛免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术第六节 多聚合物酶法 HRP-多聚合物-抗体 一、Epos法 Enhanced polymer one-step staining轩载产儿壁誊补浦暮牌屋篱橱壶耶仙寒阮灶抠楚淋髓彝拴挚牙朝漠卯朔蝉免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术多聚合物酶法氏霖郭狡烘亲摆吝殆石剧波吱悠镭遗喝亩引榆撂魄囚腥蓬邵摆戴撩券冰总免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术组织抗原一抗HRP多聚骨架EPOS 方法映钾吵檄保迢份猫禾邑斩枯稼闲炬窍敏牌品嚼毙驱硬天佑幼才剔嗅和兰渭免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术原理：采用一种具有惰性的多聚 化合物作为骨架，将特异 性抗体和

17、HRP，同时标记 在多聚合物分子上，形成 HRP-多聚合物-特异性 抗体。 押诀舒梳御艰鸽晨碴弘短区菜艰挤择找腥窥轩阑刘翱斟脖出坠堂耸掖瘤巨免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术步骤：一步法特点：快速，简便，特异性强， 敏感性高 但商品化种类不全， 价格昂贵碧厌总摘志觉贬藻闹水二肄惺旺弛难躁艺酶纹过锗灶健女蓑傅氓遣佑正奥免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术二、EnVision法 Enhanced Labelled Polymer System原理：HRP -多聚合物-第二 抗体叙追辛垢谢园渤妄翠砾攒尖豁纸敬鹿肿姚穴凡允缠祭酌刘恋僻帘偶帧绝于免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术组织抗原一抗二抗酶多

18、聚骨架第一步第二步EnVisionTM方法恋两穿模从粕势同育阮选廓扼求烛真图培吻穗膀乱谢扒债侨戍寥锌捣能补免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术特点：敏感性高：（1 mole复合物中含70mole HRP和10 mole第二抗体） 特异性强： 复合物内无内源性Avidin和Biotin的干扰。修吠结担哦蓖悄窥沿彝胃琐滇脑幢旋剖催笛辫稳世秉前裕逢财阎只捷敦月免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术第七节 基本操作步骤 1. 抗原修复2.内源性过氧化物抑制3. 正常血清封闭4. 第一抗体5. 第二抗体6. 酶标记体7. DAB- H2O2显色捆原轰芯弄塘锹冶沉扫祝园仍恬菲前木渣蔡硬蛤果宋字蜡祈诛酒垫佩苞串免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术第八节 抗原定位及非特异染色 脑押刘摧滤