绿色荧光蛋白的结构和应用

1、绿色荧光蛋白的结构和应用【摘要】文章就绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP ) 的一级结构和其发光基团的形成机理进行了分析，给出了 GFP的三 维结构，并对GFP的优点、改进方法和实际应用进行概括。【关键词】GFP结构改进应用2008年10月8日，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生 物学实验室的Osamu Shimomura (下村修)、哥伦比亚大学的Marin Chalfie和加州大学圣地亚哥分校的Roger Y.Tsien (钱永健)因发 现并发展了绿色荧光蛋白 (Green fluorescent protein， GFP)而获 得200

2、8年度诺贝尔化学奖。GFP也因此进入了更多人的视角。一、GFP的一级结构和发色团形成机理GFP是存在于水母、珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，是 Shimomura等人从Aequorea victoria中发现的。GFP含238个氨基 酸残基，分子量27kDa。野生型GFP的核苷酸序列和氨基酸序列在1992 年即被Prasher等人测定。表1为其氨基酸序列。GFP不含辅基，也不需要辅助因子，在22C左右，氧条件下，用 蓝光光源激发下可发出绿色荧光。其发色团形成于肽链65至67位 的Ser-Tyr-Gly，是分子内自催化环化生成的对羟基毗唑啉酮。首先 肽链折叠，Gly67酰胺亲核进攻Ser65的

3、羧基，并脱去一分子水形成咪唑琳酮，最后在氧作用下Tyr66的a ,。-键脱氢，此时芳基和咪 唑琳酮形成大的共轭体系，发色团成熟，可以吸收辐射并发出荧光3。 图1为示意图。GFP氨基酸序列1MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTT51GKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFF101KDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNIKGHKLEYNYNSHNV151YIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDN

4、HY201 LSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK表1： GFP的氨基酸序列dehydration图1： GFP发色团形成机理cyclizationTsien还根据发色团组分的不同将野生型GFP和其突变体分为了 7类，如含中性酚类和酚离子混合发色团的蛋白，含吲哚类的蛋白， 含咪唑类的蛋白，具有大n共轭电子体系的酚负离子的蛋白等。虽然它们的激发波长、吸收波长等荧光性质具有很大不同，但其发光 机理都与它们的一级结构密切相关，发色团形成机理类似。二、GFP的三维结构虽然1974年，野生型GFP的结品已被得到，1988年衍射图谱报 道，但是野生型GFP的结构直到1

5、996年才被解析出来。GFP的发光 基团只占全部序列的小部分，故而大部分序列是用来组成GFP的一条 a螺旋链和11条。折叠链的。其结构是圆桶状的，图2为GFP三维 结构示意图，a螺旋链沿对角线分布，p折叠链用于构成桶壁。圆桶 直径240nm，高420nm。发光基团在a螺旋上，恰位于桶的中心，被 很好地保护了起来，这与观察到的GFP相对稳定的现象和实验结果相 符。图2:GFP的三维结构示意图三、GFP的优点GFP自身的巨大优势使之迅速发展并广泛使用。汪恒英等人总结 GFP的优点有以下七条：易于检测；荧光稳定；无毒害；具有共用 性、通用性；已于构建载体；可进行活细胞定时定位观察；易于得到 突变体。

6、荧光稳定是具有GFP的生物在长期进化中的生存选择，也成为了 GFP可以在科研中实际应用的基础。已经提到从结构上可以看出，GFP 蛋白桶状结构对发色团具有良好的掩蔽作用，使发色团不会轻易暴 露，极大程度上避免了外界环境引起荧光淬灭的可能。这使得它抗光 漂白性良好，对光的耐受性强，对除垢剂、盐、有机溶剂和许多普通 酶也具有良好耐受性。四、GFP的改进野生型GFP的发色团虽然被有效地保护在了其桶状结构的中心， 但是它的荧光性质受环境，如氧化还原条件，pH条件，温度条件等 因素的影响依然存在，在一些条件下这些影响还会十分显著、 这一方面给人们设计相关的传感器探针等提供了可能，但另一方面， 也给GFP的

7、使用带来了极大的限制。其次，野生型GFP的两个激发峰 光谱（395nm主峰和475nm次峰）对应用也有不利。一个GFP分子 只有一个荧光团，有时并不能满足对荧光强度和灵敏度的要求。可以 说野生型GFP的稳定性、荧光特性等对生物体在自然环境下的生存已 经足够，但对于应用到非自然条件和复杂条件下的科研是远远不能满 足要求的，因此对野生型GFP的改进势在必行。对GFP的改进方法主要有：替换GFP生色团的氨基酸；在基因水 平上改进；对启动子进行改进等M。对生色团氨基酸的替换是最常 见的方法，如将65位的Ser换为Thr（S65T）或者Cys（S65C），将 64位Phe换为Leu（F64L）也可以提高

8、1.5到3倍的荧光强度川。这 些改进对GFP的结构没有大幅度改变，但改良了发色基团的形成。图4：第64位氨基酸的替换改良后的GFP在激发峰光谱、量子产率、对环境的敏感度等方面 都有改变，绿色荧光强度较大的增强绿色荧光蛋白EGFP就是由F64L 和S65T两个突变点造成的。改造后的荧光蛋白的光吸收和荧光行为 也可能变化，故而突变体的荧光颜色也不仅仅局限于绿色，如罗文新 等人对GFPxm改造后获得的突变体橙色荧光蛋白OFPxm，发射峰 523nm，为黄绿色，肉眼见蛋白为橙色g。另外还有黄色荧光蛋白（YFP）、蓝色荧光蛋白（BFP）、青色荧光蛋白（CFP ）等，此外类 似GFP和EGFP,还有相应的

9、增强黄色荧光蛋白 （EYFP）和增强青色 荧光蛋白（ECFP）等13。利用氨基酸、核苷酸点突变等方式研究GFP的突变体一方面可以 进一步了解GFP的结构和功能，而且可以获得适合不同的应用环境和 应用方式的荧光蛋白。可以说这些GFP改良体的产生是推动这类物质 成为生物化学与荧光分析领域一个广被青睐的标记物的重要原因。四、GFP及其突变体的实际应用GFP荧光是应用的核心。GFP的应用主要有两大类，一是作为标记物， 利用其发出荧光的特性对分子进行标记，进一步可对对细胞、个体进 行标记、定位；或是利用其荧光对环境的反应制造相应的传感器。（一）作为标记物的应用GFP分子量较小，毒性小，对目的蛋白的正常功

10、能、定位等几乎 无影响，因此把GFP作为标签融合到目的蛋白上，以研究目的蛋白在 活细胞中的定位、迁移、相互作用等已成为一项较为成熟的应用。在 应用荧光共振 能量转 移法 （fluorescence resonance energy transfer, FRET）检测蛋白相互作用和蛋白构象变化时，CFP和YFP 常被作为FRET的给体荧光团和受体荧光团10。GFP还可作为报告基因使用。将GFP基因连接到目的基因启动子 上，既可以通过检测GFP荧光强度得知基因的表达水平。相比构建基 因工程载体常用的质粒克隆载体的报告基因如LacZ，GFP不需要利用 酶促催化反应，不需要需要加入外源底物和诱导物，使

11、得操作简便、 成本降低。现在GFP已被广泛使用在转基因研究领域中，在转基因动 植物筛选和活细胞基因表达的时空成像方面都有重要应用14、15。GFP还可作为亚细胞结构的标记物，内质网、高尔基体、细胞膜、 线粒体等都可被成功标记。这对于亚细胞结构的实时观测具有重大意 义，是细胞筛选、发育机理研究、药物研究等方面的有力方法。标记还可针对个体。如用GFP对微生物进行标记，可以方便地对 微生物进行跟踪、研究16；还可以利用GFP及突变体、类似物的标记 对生物的迁徙、种群变化等情况进行研究。（二）作为传感器的应用从GFP发色团的形成以及其稳定性等方面来看，pH、温度、氧化 还原条件等对其荧光都有影响，这种

12、荧光对环境的响应可以作为传感 器的原理加以利用。pH检测器Phluorin就是一例。Phluorin可以检测活细胞内pH。 当pH降低，比率Phluorin最大激发波长从395nm向475nm转移，可 用这两个波长处荧光强度的比率来计算pH；盈缺Phluorin在pH6 条件下475nm峰无荧光。Llopis等人设计了 GFP探针，测量了细胞 不同部位的pH17，图5为不同pH下EGFP的吸收光谱。现在GFP的 pH探针还在不断发展，适用范围进一步扩大18。8cnqosq30Q350400450500550600Wavelength (nm)图5:不同pH下EGFP的吸收光谱GFP用于Ca2+

13、的指示剂也比较成熟。Ca2+是细胞内常见的第二信 使，参与多种细胞过程，对Ca2+的检测具有很重要的实际意义。人们 构建了例如 CameleonsM，GFP-Aeqorin，Camgoroo， Pericams 等基 于GFP的探针。这些传感器的原理都是在GFP蛋白基础上连接一个对 钙离子敏感的肽，如钙调蛋白结合肽(M13)，利用这个敏感部位对 Ca2+响应后对GFP部分荧光效应的影响来达到钙离子的可视化检测。 细胞内氧化还原水平对细胞的生理功能能否正常发挥起到至关重要 的作用。Dooley等人设计的GFP突变体roGFP1和roGFP2可以对细 胞内氧化还原水平进行实时监测20。图6和图七分

14、别为roGFP1和 roGFP2在氧化还原态下的荧光激发光谱。Excitation wavelength (nm)图6： roGFPl荧光激发光谱Excitation wavelength (nm)图7： roGFP2荧光激发光谱另外GFP及变体还可以用于检测卤素离子和检测电位。GFP发现初期经历过曲折的发展，最终其优势被发现、认可，成 为现在被广泛应用的一类标记物。这与其结构的天然优势是分不开 的。如今GFP的发光机理还并不完全明确，在应用中还有许多不足， 可以说其发展还有巨大空间，前景可观。【参考文献】Prasher D C, Eckenrodeb V K, Wardc W W, Pren

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