一轮复习 苏教版 基因工程的基本工具和基本操作程序（117张） 课件

1、基因工程的基本工具和基本操作程序第6课时课标要求1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三 种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载 体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行 虚拟PCR实验。考点一基因工程的基本操作工具考点二基因工程的基本操作程序考点三PCR技术、电泳鉴定及DNA的粗提取和鉴定内容索引重温高考 真题演练课时精练基因工程的基本操作工具考点一1.基本工程的概念

2、(1)供体：提供 。(2)操作环境： 。(3)操作水平： 水平。(4)原理： 。(5)受体：表达目的基因。(6)本质：性状在 体内的表达。梳理归纳 夯实必备知识外源目的基因体外分子基因重组受体拓展基因工程的理论基础2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)特定脱氧核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端(2)DNA连接酶磷酸二酯键大肠杆菌黏性末端黏性末端(3)载体噬菌体的衍复制原点生物图解限制酶的选择原则延伸应用(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择Pst，而不选择Sma。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要

3、破坏这些结构，如图乙中不选择Sma。图解限制酶的选择原则延伸应用(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中Pst；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择Pst和EcoR两种限制酶。考向基因工程的基本工具1.(2022青岛市高三期中)下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是考向突破 强化关键能力注：Y为C或T，R为A或G。限制酶名称识别序列和切割位点限制酶名称识别序列和切割位点BamHGGATCCKpnGGTACCEcoRCAATTCSau3AGATCHin

4、dGTYRACSmaCCCGGGA.Hind、Sma两种限制酶切割后形成平末端B.Sau3A限制酶的切割位点在识别序列的外部C.BamH和Sau3A两种限制酶切割后形成相同的黏性末端D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列限制酶名称识别序列和切割位点限制酶名称识别序列和切割位点BamHGGATCCKpnGGTACCEcoRCAATTCSau3AGATCHindGTYRACSmaCCCGGGHind、Sma两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A项正确；Sau3A限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B项正确；BamH限制酶识别GGATCC序列，Sau3A限制酶识别GATC

5、序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C项正确；Hind能识别GTCAAC，也能识别GTTAAC，D项错误。限制酶名称识别序列和切割位点限制酶名称识别序列和切割位点BamHGGATCCKpnGGTACCEcoRCAATTCSau3AGATCHindGTYRACSmaCCCGGG2.(多选)第三代疫苗DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是Bgl、EcoR和Sau3A。下列分析错误的是A.构建DNA疫苗时，可用Bgl和Sau3A

6、切割目的基因和质粒B.图乙中只用EcoR切割后的质粒， 含有1个游离的磷酸基团C.用EcoR切割目的基因和质粒， 再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物D.抗原基因在体内表达时不需要解旋酶从图甲看出，用EcoR切割目的基因后两端各有一个切口，与图乙中EcoR切口对接时，可有两种可能，即可产生两种重组DNA，C项错误；基因表达包括转录和翻译，转录时不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D项正确。3.下列有关基因工程中载体的说法，正确的是A.在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒B.所有的质粒都可以作为基因工程中的载体C.质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子D

7、.作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记 基因在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；具有一至多个限制酶切点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在受体细胞中复制并稳定保存，D正确。基因工程的基本操作程序考点二1.目的基因的获取(1)化学合成法直接人工合成目的基因：一般为比较小的目的基因。(2)基因文库获取目的基因：来源可分为 文库和 文库。基因组文库：指含

8、有某种生物体 基因片段的 的克隆群体。从基因组文库中筛选某种目的基因，一般采用 。cDNA文库：从组织细胞中提取 ，逆转录成cDNA，与适当载体连接后转化宿主，包含着细胞全部 克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。梳理归纳 夯实必备知识cDNA基因组全部重组DNA核酸探针杂交法mRNAmRNA信息的cDNA2.基因表达载体的构建(1)目的：使目的基因进入_ 。(2)基因表达载体的组成及作用受体细胞并有效表达，而且要能稳定存在且遗传给后代启动子RNA聚合酶标记基因(3)构建过程易错提醒启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质_位置目的基因上游目的基因下游

9、mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号(编码氨基酸)翻译的结束信号(不编码氨基酸)DNADNAmRNAmRNA3.将目的基因导入受体细胞生物种类植物哺乳动物微生物常用方法农杆菌转化法显微注射法 处理法受体细胞_原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的TDNA中农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的染色体DNA上表达取卵将含有目的基因的表达载体注入受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞细胞处于一种容易接受外来DNA的生理状态基因表达载体导入体细胞或受精卵受精卵Ca2辨析(1)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入第一

10、次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的 上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的TDNA拼接到受体细胞的 上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入 ，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的TDNA导入 。TDNA染色体DNA农杆菌受体细胞(2)农杆菌特点能在自然条件下侵染 和 ，而对大多数_ 没有侵染能力。农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的TDNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。辨析双子叶植物裸子植物单子叶植物Ti质粒4.目的基因及其表达产物的检测鉴定考向基因工程的基本操作程序4.(2022江苏高三联考)戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF

11、2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是A.过程需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、CB.重组基因表达载体上的启动子需来源于戊型肝炎病毒C.过程需要用聚乙二醇处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分 子的生理状态D.过程大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定考向突破 强化关键能力戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，过程是以病毒RNA为模板合成DNA，获取目的基因的过程，需要的酶是逆转录酶，原料是四种脱氧核苷酸，A项错误；启动子是一段有特殊结构

12、的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶识别结合以驱动目的基因的转录，启动子具有物种或组织特异性，构建在大肠杆菌细胞内特异表达pORF2蛋白的载体时，需要选择大肠杆菌细胞的启动子，而不能选择其他物种和组织细胞的启动子，B项错误；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2处理法，需要用Ca2处理大肠杆菌，增大大肠杆菌细胞壁的透过性，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C项错误。5.下列有关基因表达载体的叙述，不正确的是A.具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增B.具有启动子，作为多肽链合成的起始信号C.具有标记基因，有利于目的基因的初步检测D.具有目的基因，以获得特定的基因表达产物基因

13、表达载体必须使目的基因能够在受体细胞内进行表达，具有启动子(启动转录)，作为RNA合成的起始信号，B错误。6.(2021全国乙，38)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，上图中_酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接，上图中_酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。EcoR、PstEcoR、Pst、Sma和EcoR限制酶EcoR和Pst切割形成的是黏性末端，限制酶Sma

14、和EcoR切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoR和Pst切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶Sma和EcoR切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4 DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是_。磷酸二酯键(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体

15、细胞中能_；质粒DNA分子上有_，便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是_。自我复制一至多个限制酶切割位点用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)表达载体含有启动子，启动

16、子是指_。位于基因上游的一段有特殊序列结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程PCR技术、电泳鉴定及DNA的粗提取和鉴定考点三1.PCR技术(1)过程变性：94 条件下受热 后解链为单链退火：55 条件下， 与单链相应互补序列结合延伸：72 条件下在 作用下合成子链变性梳理归纳 夯实必备知识引物TaqDNA聚合酶思考分析在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成 的原料，又可为DNA的合成提供 。引物既可以是DNA单链，也可以为 。细胞内的DNA进行复制时，也需要 ，一般为RNA片段。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要

17、激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加 。DNA子链能量RNA单链引物Mg2Mg2思考分析PCR扩增过程中的循环图示与规律思考分析循环次数123nDNA分子数2_含引物A(或B)的DNA分子数1_同时含引物A、B的DNA分子数0212_共消耗的引物数量22112622121423122n12482n2n12n26232222237(2)PCR技术和DNA复制的比较(3)DNA的电泳鉴定微量取液器2.DNA的粗提取和鉴定(1)基本原理原理：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。DNA的性质：DNA不溶于 ，但某些蛋白质溶于 ；DNA能溶于2

18、molL1的 。DNA的鉴定：在一定温度下，DNA遇 试剂会呈现蓝色。酒精酒精NaCl溶液二苯胺(2)过程蒸馏水NaCl同一方向沸水浴轻轻考向一PCR技术及电泳鉴定7.(多选)利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析正确的是A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增 的结果B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基C.过程需要先加热至约94 后再冷却至约55 左右D.过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD考向突破 强化关键能力8.利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的相

19、关叙述，错误的是A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高 压蒸汽灭菌处理B.PCR利用了DNA的热变性原理C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的 枪头都必须更换PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分，同样保护酶的活性不被破坏，C错误。考向二DNA的粗提取与鉴定9.下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是A.新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取B.选用洋葱作为实验材料时可以使用吸水涨破法破坏细胞C.DNA可溶于蒸馏水

20、，也可溶于2 mol/L的NaCl溶液D.溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后，颜色呈紫色猪是哺乳动物，其红细胞没有细胞核，所以猪血不能用于DNA的粗提取，A错误；植物材料不能使用吸水涨破法破坏细胞，B错误；DNA不溶于95%的冷酒精，可溶于蒸馏水，也可溶于2 mol/L的NaCl溶液，C正确；溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，需沸水浴加热后冷却，再观察颜色(呈蓝色)，D错误。重温高考 真题演练1.(2019江苏，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂C.预冷的酒精可用

21、来进一步纯化粗提的DNAD.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热12345哺乳动物(如兔)成熟的红细胞中无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液，预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。123452.(2020北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效

22、启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是A. B.C. D.12345引物扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物扩增的片段不含启动子，引物扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。图示中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是，B正确。123453.(2020浙江7月选考，24)下列关于基因工程的

23、叙述，正确的是A.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶，则一定有利 于该重组质粒进入受体并保持结构稳定B.抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草 剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关C.抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性 鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表 达抗性基因RNAD.已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带，用某种限 制性内切核酸酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少 有3个被该酶切开的位置123451

24、2345基因工程中，若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶(简称限制酶)，重组质粒进入大肠杆菌体内后，该限制酶可以切割重组质粒，使重组质粒不能保持结构稳定，A项错误；将抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐，若抗除草剂基因转入到抗盐基因的编码区，破坏了抗盐基因，则会出现由抗盐到不抗盐的改变，可说明抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入有关，B项错误；12345抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂，则前者应表达了抗性蛋白，而后者可能表达了抗性基因RNA但不能进行翻译过程，也可

25、能没有表达出抗性基因RNA，C项错误；已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带，用某种限制性内切核酸酶完全酶切环状质粒后，出现几条带则表明该质粒上一定至少有几个被酶切开的位置，注意若完全酶切链状DNA后，出现3条带，则表明该DNA上一定至少有3个被酶切开的位置，D项正确。4.(2020江苏，33)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR 酶切为例)：12345请据图回答问题：(1)步骤用的EcoR是一种_酶，它通过识别特定的_切割特定位点。限制性内切核酸(或限制)核苷酸序列步骤 用的EcoR 是一种限制性内切核酸

26、酶，它通过识别特定的核苷酸序列来进行切割。12345(2)步骤 用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3羟基与5磷酸间形成_；PCR循环中，升温到94 是为了获得_；Taq DNA聚合酶的作用是催化_。磷酸二酯键DNA单链以DNA为模板的DNA链的延伸12345步骤中用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3羟基与5磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升温到94 是为了解开DNA双链获得DNA单链，TaqDNA聚合酶的作用是催化以DNA为模板延伸形成子链的过程。12345(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤选用的PCR引物必须是_(从引物中选择，填编号)。DNA序列(虚线处省

27、略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物5AACTATGCGCTCATGA35GCAATGCGTAGCCTCT35AGAGGCTACGCATTGC35TCATGAGCGCATAGTT312345PCR过程中，根据已知的DNA序列合成两个引物，要注意模板链和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能够和相应模板的核苷酸序列发生碱基互补配对，环状DNA图中显示PCR过程是从已知DNA序列的两端分别向相反方向形成子链，一个引物是与已知DNA序列的第一条链的左端互补结合，向右侧方向延伸形成子链，该引物是，另一个引物是与已知DNA序列的第二条链的右端互补结合，向左侧方向延伸形成子链，该引物是。12345(4

28、)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是_。A.5AACTATGCGAGCCCTT3B.5AATTCCATGCTGAATT3C.5GCAATGCGTTCGGGAA3D.5TTGATACGCCGAGTAC3B12345图中由片段F形成的环状DNA的未知序列中有一个EcoR 限制酶的切割位点，而EcoR识别的位点是 ，因此片段F的单链中的一端应含有“AATTC”序列，另一端应含有“TTAAG”序列，只有B项符合题意。5.(2021山东，25)人类基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合BCL11A

29、蛋白后，基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进12345行基因治疗。科研人员扩增了基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1F7末端添加的序列所对应的限制酶是_，在R末端添加的序列所对应的限制酶是_。12345本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要_种酶。SalEcoR612345据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达

30、，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶Mun识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。12345要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有Mun和Xho的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶Mun和Xho所识别，故应该选用添加限制酶EcoR和限制酶Sal识别序列，由图中可知，限制酶Mun识别并切割后的黏性末端12345与限制酶EcoR识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所对应的限制酶是

31、EcoR，在F1F7末端添加的序列所对应的限制酶是Sal；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR的识别位点，故对载体使用限制酶Mun和Xho切割。综上所述，对载体使用限制酶Mun和Xho切割，对扩增后的产物用限制酶EcoR和限制酶Sal切割，然后在12345DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用TaqDNA聚合酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是TaqDNA聚合酶、限制酶EcoR、限制酶Sal、限制酶Mun、限制酶Xho、DNA连接酶。(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1F6与R扩增产物的载体表达

32、荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原12345因是_。F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达12345受体细胞中已经除去BCL11A基因，故扩增产物中的BCL11A蛋白结合位点不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含F1F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌性激素，含F1F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5F

33、6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于_，理由是_。12345引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上根据有无荧光情况判断，F1F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上12345向培养液中添加适量的雌性激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生BCL11A蛋白，BCL11A

34、蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含F1F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A蛋白的结合位点在引物F4与引物R之间的序列上；含F5F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A蛋白结合位点在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。一、易错辨析1.限制酶也可以识别和切割RNA()2.DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来()3.E.coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端()4.用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物()5.DNA不溶于酒精，但某些蛋白

35、质溶于酒精()6.在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关()五分钟查落实二、填空默写1.(选择性必修3 P87)基因工程：_的技术。2.(选择性必修3 P87)限制酶的_。又称DNA重组技术，指在体外通过人工 “剪切”和“拼接”等方法，将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA，然后导入受体细胞，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物特异性很强，能识别DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开3.(选择性必修3 P89)E.coli DNA连接酶，可以用于连接具有 的DNA分子；T4 DNA连接酶，可以用于连接具有 的

36、DNA分子。4.(选择性必修3 P90)PCR反应需要在一定的 中才能进行，需提供 、 、4种 和热稳定的 。5.(选择性必修3 P97)基因表达载体除目的基因外，还应该包括_ 等。黏性末端黏性末端或平末端缓冲液DNA模板引物对dNTPDNA聚合酶复制原点、启动子、终止子和标记基因6.(选择性必修3 P98)农杆菌转化法是_。将目的基因插到农杆菌Ti质粒的TDNA特定片段上，再通过TDNA将其插入受体细胞染色体的DNA上，使目的基因得到稳定的遗传和表达课时精练一、单项选择题1.(2022江苏扬州高三期中)目前研究混杂DNA群体中的特异DNA序列，一般基于两种不同的方法，即DNA克隆和DNA分子

37、杂交，如图所示。下列有关叙述错误的是A.方法需要限制酶和DNA连接酶B.方法需要解旋酶和DNA聚合酶C.方法需要对探针进行特殊标记D.方法都遵循碱基互补配对原则123456789101112方法中将目的基因与载体切割和连接制成重组DNA，需要限制酶和DNA连接酶，A正确；方法体外扩增技术中变性退火延伸，不需要解旋酶，B错误；方法需要对探针进行特殊标记，这样才能特异性检测，C正确；方法都遵循碱基互补配对原则，D正确。1234567891011122.下图为DNA分子的某一片段，其中分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是A.DNA 连接酶、限制酶、解旋酶B.限制酶、解旋酶、DNA 连接酶C.解

38、旋酶、限制酶、DNA 连接酶D.限制酶、DNA 连接酶、解旋酶1234567891011是氢键，是解旋酶的作用位点；是磷酸二酯键，限制酶可将其断裂；处为两个DNA片段的缺口，DNA连接酶可将DNA片段之间的磷酸二酯键连接起来。123.为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符合的是A.用限制性内切核酸酶EcoR和 DNA连接酶构建重组质粒B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈 伤组织，将C基因导入细胞C.在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞D.用DNA分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上1

39、234567891011121234567891011图2中显示标记基因是潮霉素抗性基因，因此可在培养基中添加潮霉素，筛选被转化的菊花细胞，C错误。124.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述，错误的是A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶B.变性过程中，双链DNA的解开不需要解旋酶C.复性过程中，引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.延伸过程中，需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸81234567891011125.利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙

40、述错误的是A.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基 因的全部序列B.设计引物时需要避免引物之间形成碱基 互补配对而造成引物自连C.复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物D.第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为 15/161234567891011121234567891011用PCR方法扩增目的基因时，要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成(两种)引物，但不必知道基因的全部序列，A正确；复性的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，因此复性温度过高可能引起两种引物不能与两条DNA单链结合，进而导致PCR反应得不到任何扩增产物，C

41、正确；121234567891011DNA复制为半保留复制，第四轮循环即DNA复制4次，共形成2416个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余14个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为14/167/8，D错误。126.(2022江苏泰州中学模拟)在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，不正确的是A.该载体最可能为环形DNA分子B.两种限制酶在载体上各有一个酶切位点C.限制酶R1与R2的切割位点最短相距2

42、00 bpD.限制酶作用于该载体会导致氢键和肽键断裂1234567891011121234567891011由题可知，当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；由题可知，当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；121234567891011由题可知，两种限制酶同时切割时则产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点至少相距200 bp，C正确；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点上两

43、个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。127.(2022扬州市高三期中)实时荧光RTPCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RTPCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是123456789101112A.做RTPCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA 后再进行扩增C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感

44、染病毒D.病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原 理都是抗原抗体杂交1234567891011121234567891011PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板，所以需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增，B正确；若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者极有可能感染了病毒，C错误。12二、多项选择题8.(2022江苏常州高三期中)ROP蛋白可以参与调节根毛和花粉管的生长。科研人员采用含有GFP(绿色荧光蛋白)基因的载体构建了ROPGFP的质粒，并利用农杆菌转化法将其转入植物体内。下列有关叙述正确的是A.外源基因在植物体中是否表达可通过绿色

45、荧光来检测B.GFP基因在植物体中表达说明生物体共用一套密码子表C.ROPGFP质粒的构建需用到限制酶、DNA聚合酶和载体等工具D.利用农杆菌转化法可以侵染大多数单子叶植物1234567891011121234567891011导入的载体含有GFP(绿色荧光蛋白)基因，可以指导绿色荧光蛋白合成，若在植物体中表达，则可以表现出绿色荧光，A正确；GFP基因在植物体中表达，GFP基因在受体中也能转录、翻译为绿色荧光蛋白，说明供体和受体都共用一套密码子表，B正确；ROPGFP质粒的构建需用到限制酶、DNA连接酶和载体等工具，C错误；由于农杆菌对大多数单子叶植物没有感染能力，因此将目的基因导入这类植物的

46、时候，一般采用的方法有基因枪法和花粉管通道法，D错误。129.农杆菌Ti质粒上的TDNA可以转移并随机插入到被侵染植物的染色体DNA中。研究者将下图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板，利用PCR技术扩增出TDNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定TDNA插入的具体位置。下列说法正确的是1234567891011A.进行PCR扩增的依据是DNA分子双链复制的原理B.进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和热稳定DNA聚合酶C.利用图中的引物、组合可扩增出两侧的未知序列D.通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定TDNA的插入位置121234567891011PCR扩增依据的是DNA分子双链复

47、制的原理，A正确；进行PCR扩增需要热稳定DNA聚合酶，但不需要解旋酶，B错误；DNA的两条链反向平行，子链从引物的3端开始延伸，则利用图中的引物、组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；通过与受体细胞的基因组序列比对，即可确定TDNA的插入位置，D正确。1210.某中学生物兴趣小组进行DNA的粗提取与鉴定时，选取如下实验材料：新鲜花椰菜、体积分数为95%的冷酒精、研磨液(含表面活性剂SDS、DNA酶抑制剂EDTA、适量的NaCl)、0.015 molL1的NaCl溶液、二苯胺试剂、蒸馏水以及其他必要实验器材。下列有关选择实验材料的理由，叙述正确的是A.新鲜的花椰菜DNA含量丰富，易获取B.SDS

48、具有瓦解植物细胞质膜的作用C.DNA溶于冷酒精，而蛋白质等杂质不溶D.EDTA可减少提取过程DNA的降解123456789101112三、非选择题11.如图pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素(一种抗生素)抗性基因；mel为黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而三种限制酶Sac、Sph、Bgl在pIJ702上分别只有一处识别序列。回答下列问题：1234567891011pIJ702pZHZ8Bgl5.7 kb6.7 kb表1121234567891011表2固体培养基中硫链丝菌素浓度(g/mL)012510不含质粒的链霉菌生长状况注：“”表示生长；“”表示不生长。12(1)限制酶可以识别双链DNA中特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的_断裂，切割形成的末端有_两种。1234567891011磷酸二酯键黏性末端和平末端12(2)以Sac 和Sph 切取目的基因，与质粒pIJ702上长度为0.4 kb的Sac/Sph片段进行置换，构建重组质粒pZHZ8。上述两种质粒经限制酶Bgl 酶切后所得片段长度见表1。由此判断目的基因的片段长度为_kb，判定目的基因中含有一个Bgl 切割位点的理由是_。12345678910111.4pIJ702pZHZ8Bgl5.7 kb6.7 kbpIJ702上的原有Bgl切割位点被目