解惑练4　新冠病毒的检测

1、解惑练4新冠病毒的检测.检测患者因新冠病毒而产生的特异蛋白质新型冠状病毒IgM抗体快速检测试剂盒,该试剂盒采用间接法检测人新型冠状病毒IgM抗体, 仅需采取一滴血就有望在15分钟内肉眼观察获得检测结果，且患者的血浆稀释500至1 000 倍后，仍能检测出阳性条带。其实质为利用抗原一抗体杂交技术，但是无论如何，现在抗体 检测还不能完全替代核酸检测。.检测新冠病毒的核酸新型冠状病毒是一种仅含有RNA的病毒，病毒中特异性RNA序列是区分该病毒与其他病原 体的标志物。检测原理：核酸检测盒包括：逆转录酶试剂、病毒核酸标准试剂、热稳定DNA聚合酶、引物序列、特 异性的荧光DNA探针（带荧光的一段特异性的新

2、冠病毒的核酸序列，这个是最关键的，如果 特异性不强或者是病毒在这一段发生变异，则很可能会判定为阴性，影响结果）等。目前采用 RT-PCR技术（逆转录荧光PCR技术）。先从样本中提取RNA, RNA中可能有新冠病毒的RNA,同时也存在很多采样患者的组织 和存在于采样部位的微生物的RNAo先通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA。因为新冠病毒中的核酸为RNA,而RNA 极易降解，为了防止我们检测的物质在检测过程中降解，我们把它转换为更稳定的DNA。检测扩增出的PCR产物，即DNA片段。我们扩增的病毒DNA片段能够发出荧光而被仪 器检测到。这些扩增出的供我们检测的产物的多少，很大程度上取决于样本

3、中目标RNA量 的多少。而目标RNA量的多少又与样本中病毒的多少相关。下图显示了相关原理：在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该 探针为一段特异性寡核甘酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整 时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与 模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离， 发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光 到达预先设定阈值的循环数（Ct值）与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小。L热变性 引物探针包淬灭

4、荧荧光基团y5光基团2 .引物复性/探针与模板的杂交聚合昭.探针杂交电3.延伸反应懑二一多【跟踪训练】1. （2022.潍坊期末考试）“防疫攻坚进行时，不再是说走就走的旅行”，为控制跨境传播，我 国驻多国大使馆先后发布通知，赴华人员需要提供新冠病毒核酸检测及血清抗体检测的双阴 性证明。目前，PCR技术（荧光PCR法）是病毒核酸检测的主流方法，是新冠病毒检测试剂盒 采用最多的技术。IgM/IgG联合检测（胶体金法）是新冠抗体检测试剂盒主要采用的技术。请分 析回答下列问题：新冠病毒是RNA病毒，所以需对样本进行 处理后再PCR扩增，如果样本存在目标病原体，则会因为 的特异性，扩增出相应的目标基因片

5、段，由此判断是否为阳性。（2）荧光PCR法，又称qPCR法，是指在反应体系中加入,通过专门仪器实现实时 荧光检测，以 来测定PCR循环后产物中核酸水平。（3）IgM和IgG均属于免疫球蛋白家族，是机体在抗原物质刺激下由浆细胞产生的抗体。 IgM/IgG检测试剂盒的原理是,通过检测人体内相应抗体间接证明是 否感染。被病毒感染后，机体会产生一系列的变化来抵御这种入侵，其中IgM和IgG的含量 会发生如图所示变化。抗体检测升1W : 及- 沼： 我- 妾：I矍广 IgM+IgG7IgG抗体： ；IgM抗体IgG再次感染IgM+agGIgG ： g病Ig力抗体、I-14 -7 0 7 14 21 28

6、35 42发病后天数-14 -7 0 7 14 21 28 35再次感染天数通过对COVID19患者研究发现，病毒侵入人体后，大约需要57天产生IgM抗体，IgG抗体在感染后1015天时产生。通过检测外周血中IgM和IgG,不仅可以鉴别是否感染， 还可以辨别检测者是近期感染或者是既往感染。当核酸检测结果为阳性，IgM（+）IgG（一）时, 可判断检测者为:已治愈的患者检测结果应为答案（1）逆转录引物（2）荧光物质荧光强度（3）抗原与抗体特异性结合近期感染 核酸检测结果为阴性，IgM（ 一）IgG（ + ）解析（1）基因工程中，目的基因的获取方法有两种，一种是直接从基因文库中获取，另外一 种是人

7、工合成，人工合成的方法必须已知目的基因序列，方法有两种，DNA合成仪合成和 PCR技术合成。PCR是扩增DNA的一种方法，如果是RNA病毒，首先要转化成DNA,也 就是逆转录；利用PCR技术进行新冠病毒核酸检测时，如果样本存在目标病原体，就会因为 引物的特异性，扩增出相应的目标基因片段，由此判断是否为阳性。荧光PCR是通过荧 光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，通过专门仪器实现实时荧光 检测，以荧光强度的高低来判断PCR循环后产物中的核酸水平。（3）新型冠状病毒基因编码 多个结构蛋白，这些蛋白包括多个抗原位点，利用抗原与抗体特异性结合的原理，可通过抗 体检测抗原的存在，从

8、而直接证明样本中含有新型冠状病毒，间接证明机体感染与否。2”实时荧光定量qPCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在12 h内即可得到检测结果。 TaqMan探针是实时荧光定量RTPCR技术中一种常用探针（如图1）,其5端连接荧光基团 （R）, 3端连接淬灭剂（Q）。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR 扩增过程中，当ZqDNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q, R发出的 荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步（如图2）。请据图回 答：病毒样品RNA双链DNA引物、探针与模板链结合I/T叫Man探针新链延伸遇到探针TaqMan探针T

9、aq酶切割探车产感J、一选驾荧光色吗,R在猫、 仪器检测Jaq酶/、一新链聚合完成、血结合图1和图2分析，“荧光RT-PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有 酶、酶、TaqMan探针、引物、dNTP、Mg2+缓冲剂等。这种分子层面的荧光RTPCR检测具有特 异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的、 有关。（2）根据TaqMan探针功能分析，探针中碱基序列的设计应主要依据。新冠病毒 （2019 nCoV）是冠状病毒大家庭中的新的一员，其碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序 列有79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，因此在设计TaqMan探针时应筛选出2019 nCoV特有序列，

10、以避免（填“假阴性”或“假阳性”）的出现。（3）根据图1和图2,八的DNA聚合酶除了能催化DNA子链的延伸,还能。（4）若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a,则反应体系中某时刻荧光信号强度（Rn） 主要与、有关。在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物 不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，增加了检测结果的准确性，一般要 达到或超过阈值时才确诊。可通过荧光强度的变化监测产生量的变化从而得到一条荧光扩增 曲线图（如下图）。“平台期”出现的最可能的原因是试剂盒中 等有限，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加。卜平台期1卜平台期1Cycle（循环数）阈值(熙阳M联)UX（5）虽然荧光RTPCR是当前被广泛认可的检测手段之一，但是不断有“假阴性”现象报道, 通过上述过程分析，“假阴性”的可能原因有（填字母）。a.通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足b.在样本运输、检测中出现了损坏和污染c.病毒相应关键序