医学微生物学：第14章 病毒感染的检查方法与防治原则

1、2022/8/111第十四章 病毒感染的检查方法与防治原则Detection, prevention and treatment of viral infection宿主防御区段病毒学 （VIROLOGY）2022/8/112 病毒感染的检查方法 病毒感染的防治原则2022/8/113Diagnosis of viral infection病毒感染的检查DiagnosisVirusSpecific Ab.V.particlesViral Ag.Viral DNA/RNAViral enzymes EM: virus particle LM: inclusion body Inoculation

2、 and Cultivation2022/8/114一、标本的采集与送检Collection and transport of specimens原则基本与细菌相似，但应注意： 1.急性期标本 2.根据感染性质取不同标本 3.标本用“双抗”处理 4.低温快运 5.血清学诊断采双份血清2022/8/115二、病毒的分离与鉴定Viral isolation and identification一般程序：标本无菌处理动物接种鸡胚培养细胞培养出现症状指标阳性指标阴性细胞病变 病毒鉴定 盲传23代指标阴性病毒阴性2022/8/116应用：尚无敏感细胞的病毒培养动物：兔、鼠、黑猩猩、猴等优点：观察发病，可

3、建立动物模型缺点：有饲养条件要求，费用高， 动物体内常带有潜伏病毒1. animal inoculation2022/8/1172. embryonated eggs inoculation 2022/8/118绒毛尿囊膜：Poxvirus、HHVs尿囊腔：influenza、mumps virus羊膜腔：influenza初次分离卵黄囊： neurotropic viruses 2. embryonated eggs inoculation 采用孵化914天的鸡胚接种部位 2022/8/119优点：易管理，不带微生物，成本较低缺点：操作程序复杂2. embryonated eggs inoc

4、ulation 2022/8/11103. Tissue or cell culture 单层细胞培养（monolayer cell culture） 分类 悬浮细胞培养（suspended cell culture） 原代细胞（primary cells）细胞种类 二倍体细胞（diploid cells） 传代细胞系（continuous cell lines）2022/8/1111贴壁生长细胞细胞培养瓶单层细胞2022/8/11122022/8/1113(1)原代和次代细胞培养组织 组织块 分散的单个细胞 单层细胞 剪碎 培养基(原代细胞)单层细胞(次代细胞)传代培养蛋白酶 2022/8/

5、1114特点：对多种病毒敏感 生长能力有限, 获取成本高 可携带潜伏病毒(1)原代和次代细胞培养2022/8/1115 体外分裂50100代仍保持二倍体染色体数目，可用于病毒分离和疫苗生产。特点：对多种病毒敏感 不带异种蛋白(人源性) 不带病毒，无致瘤潜能 可传50代左右(2)二倍体细胞培养2022/8/1116(3) 传代细胞培养：来自癌细胞、自发转化或突变细胞。特点：对多种病毒敏感性高 繁殖能力高，传代时间长 有致癌危险，不能用于疫苗生产2022/8/1117 normal cellsmultiplyvirusproduce CPE CPE including: * morphologic

6、 changes: cell lysis, necrosis, and cytoplasm vacuolization. * fusion of cells form multinucleated giant cells: Measles virus, CMV, respiratory syncytial virus； * inclusion body formation: Rabies virus, measles virus. When a specimen containing virus, which is add to the appropriate cell line, cytol

7、ogical changes occur that are characteristic for a particular virus. (CPE)病毒的鉴定1病毒在培养细胞中增殖的指标2022/8/1118measles virusrespiratory syncytial virus fusion of cells form multinucleated giant cellscytopathic effect, CPE2022/8/1119 inclusion body formationcytopathic effect, CPE2022/8/1120Detection of Viru

8、s Infected Cells- Not produce a CPE Adsorption Erythrocytes to Infected Cells: Hemagglutination Assay Interference: When two different viruses infect the cells. First non-CPE virus may be inhibit the replication of second virus that induce CPE in infected cells. Metabolic Changes: Such as the pH red

9、uces.2022/8/1121Hemagglutination Assay病毒包膜表面血凝素(HA)红细胞表面HA受体Influenza virus hemagglutinin trimerHemagglutination Assay-red cell agglutination test2022/8/1123Hemagglutination Assay2022/8/1124 鉴定病毒种、型（亚型） 红细胞凝集和血凝抑制试验 病毒鸡红细胞凝集（血凝试验+） 病毒特异性抗体鸡红细胞不凝集 （血凝抑制试验+） 病毒的分型与鉴定 检测血凝抑制抗体 Known Ab.+new isolated vi

10、rusKnown virus +early, late sera of patientsHemagglutination inhibition test2022/8/1125病毒感染性测定及病毒数量测定1. 血凝试验：病毒总量（活病毒死病毒）2. 蚀斑形成试验 （plaque formation test） 3. 50组织细胞感染量 （50 tissue culture infectious dose, TCID50）感染性病毒量2022/8/1126PLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAY2022/8/1127PLAQUE ASSAY2022/8/1128PLAQUE ASSAYPL

11、AQUE ASSAY2022/8/1129Plaque Assay: Plaque Forming Unit2022/8/1130Plaque assay: pfu2022/8/1131Detection of virus amount and infectivity- TCID50 or PFU TCID50 (50% tissue culture infective dose) : Infections dose of 50% CPE of tissue cultures caused by viral minimum infected dose is called TCID50.2022

12、/8/1132病毒颗粒病毒成分（Ag.或核酸） 早期Ab检测（IgM）1.病毒形态学检查电镜免疫电镜：设备、操作复杂，应用受限光学显微镜：可见大病毒（痘类病毒）， 对一般病毒检测意义不大Quick diagnosis of viral infection2022/8/1133（二）病毒蛋白Ag检测酶联免疫吸附试验(ELISA)免疫荧光测定(IFA)放射免疫测定(RIA)蛋白质印迹(WB)2022/8/1134酶联免疫吸附试验（ELISA,间接法）2022/8/1135Detection Viral Antigen Some viral infections can be detected by

13、 making a specific antibody against the virus: The antibody is conjugated to a tag such as a fluorescent dye (IFA) and Radioimmunoassay(RIA)2022/8/11362022/8/1137（三）、检测病毒核酸 核酸电泳 核酸杂交（dot,in situ） 核酸扩增技术（PCR） 基因芯片 基因测序2022/8/1138Detection Viral nucleic acidRestriction Endonuclease Analysis (REA): Res

14、triction endonuclease can cleave viral DNA at a specific nucleic sequence, and are able to produce a set of DNA fragment of viral genome. They can be separated by gel electrophoresis give a characteristic result for the virus DNA.2022/8/1139Detection Viral nucleic acidNucleic Acid Probes-sensitive a

15、nd specific The labeled (with either radioactive substance or a dye) specific methodsdot-blot hybridization Southern blot hybridization Northern blot in situ hybridization.2022/8/1140Detection Viral nucleic aciddot-blot hybridization Southern and Northern blot hybridization2022/8/1141 in situ hybrid

16、ization2022/8/11421985K Mullis, colleagues, Cetus, Perkin-Elmer invention of the polymerase chain reaction (PCR)Kary Mullis2022/8/114353535353PCR-DNA replication2022/8/11445353PCR-DNA replication353555353533535553535353535353535353532022/8/1145Detection Viral nucleic acidPolymerase chain Reaction (P

17、CR)2022/8/1146Detection Viral Antibody-Serologic Tests(1) Neutralization: (2) Complement Fixation (CF) Tests(3) Hemagglutination Inhibition (HI) Test(4) Immunodiffusion Test(5) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)2022/8/1147 Gel immunodiffusion test 多种病毒鉴定病毒感染的血清学诊断(查Ab)2022/8/1148早期抗体检测 可诊断急性感

18、染 特异性IgM抗体：孕妇感染风疹病毒 HBc IgM抗体 EBV早期抗原抗体早期抗体检测举例“优生十项”检查结果：1、单纯胞疹病毒（HSV-1)IgM抗体： 阴性 2、单纯胞疹病毒(HSV-1)IgG: +阳性 3、单纯胞疹病毒(HSV-2)IgM： 阴性 4、单纯胞疹病毒(HSV-2)IgG： 阴性 5、巨细胞病毒(CMV)IgM抗体： 阴性6、巨细胞病毒(CMV)IgG抗体： +阳性 7、风疹病毒(RV)IgM抗体： 阴性8、风疹病毒(RV)IgG抗体： +阳性 9、弓形虫（Tox)IgM抗体： 阴性 10、弓形虫(Tox)IgG抗体： 阴性 2022/8/1150(四) 新病毒的鉴定核

19、酸类型 理化性状的检测 形态学鉴定 血清学鉴定 基因测序和生物学对比Prevention and Treatment of Viral Infection1. Antiviral drugsIFN and IFN inducers gamma-globulin and antiviral specific Ig Gene therapy Artificial active immunity Artificial passive immunity(HBIG) (vaccines)2. Immunopreparation3. Prevention2022/8/1152Inactivated vac

20、cine : Japanese encephalitis, rabies, hepatitis, influenza, polio etc. ；Living vaccine ：Polio, influenza, measles;一、 Artificial active immunity2022/8/1153Live (OPV)Inactivated (IPV) 缺点： a.可被其它肠道V干扰； b.热稳定差，不易保存，而失效； c.有复毒危险（反祖），而出现 VAPP（疫苗相关麻痹性脊髓灰质炎）； d.对于免疫功能低下的儿童，可能会出 现VAPP； Advantages and disadva

21、ntages of polio vaccines 优点：a. 口服，简单易行，接种量少，次 数少，便于 投放，适合我国；b.维持时间长，有免疫放大效应c.口服为自然感染途径，可产生的 抗体 sIgA、IgG、IgM; sIgA有粘膜免疫效果。优点：a. 疫苗保存运输方便； b. 疫苗使用安全。 缺点：a. 接种量大，次数多，肌肉注射，花费较大；b.仅对接种个体有效，无免疫放大效应， 免疫维持时间短：c.无粘膜免疫效果，可产生循环抗体 2022/8/1154Subunit vaccinesGene engineered vaccinesDNA Vaccine 2022/8/1155(3) Sub

22、unit vaccines2022/8/1156（4）gene engineered vaccine： eg: Recombinant hepatitis Bvaccine2022/8/1157(5) DNA Vaccine2022/8/11582022/8/1159二、 Artificial passive immunity Ig：丙种球蛋白 细胞免疫制剂 cytokines 淋巴因子激活的杀伤细胞 LAK细胞 IFN-、IL-2、IL-6、IL-12 TNF 、CSF 2022/8/1160三、抗病毒药物或制剂 核苷类药物(疱疹净、碘苷）非核苷类反转录酶抑制剂 蛋白酶抑制剂其他抗病毒药物

23、抗病毒化学制剂反义核酸干扰RNAribozyme干扰素和干扰素诱生剂中草药 基因治疗剂 治疗性疫苗 2022/8/11612022/8/11622022/8/1163核苷类药物作用机理：（1）抑制病毒基因复制； 模拟核苷成分掺入病毒基因组； 竞争病毒复制酶。（2）抑制病毒基因转录。（一）Antiviral drugs2022/8/1164Antiviral drugsNucleoside Analogues: Analogues inhibit nucleic acid replication by inhibition of enzymes of metabolic pathways. For example: Acyclovir (ACV) is a viral polymerase inhibitor. It interferes with DNA sy