DB34-T 4204-2022 猪圆环病毒3型套式PCR检测技术规程

1、ICS11.220CCSB 41ICS11.220CCSB 41安徽省地方标准DB34/T420420223PCRTechnical regulation for nested PCR detection method for porcine circovirus type 320222022062920220729安徽省市场监督管理局发 布DB34/T 42042022前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由安徽省动物疫病预防与控制中心提出。 本文

2、件由安徽省农业农村厅归口。 I I DB34/T 42042022猪圆环病毒 3 型套式PCR 检测技术规程范围3PCRDNAPCR 本文件适用于猪圆环病毒3型核酸套式PCR检测。 （ GB/T 6682GB 19489 病死及病害动物无害化处理技术规范（农医发201725号 ） 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 猪圆环病毒 3 型 porcine circovirus type 3，PCV3猪圆环病毒属于圆环病毒科、圆环病毒属，根据其致病性、抗原性及基因组序列分为1型、2型和3 型等基因型，猪圆环病毒3型是2015年发现的新型圆环病毒亚型。 4 主要仪器设备PCR 仪。 台式高速冷

3、冻离心机：可控温至 4，离心力 12000 g 以上全自动组织快速碾磨仪。 涡旋振荡器 冰箱：28、-20、-70 三种。电泳仪。 病死及病害动物无害化处理技术规范（农医发201725号 ） 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 猪圆环病毒 3 型 porcine circovirus type 3，PCV3猪圆环病毒属于圆环病毒科、圆环病毒属，根据其致病性、抗原性及基因组序列分为1型、2型和3 型等基因型，猪圆环病毒3型是2015年发现的新型圆环病毒亚型。 4 主要仪器设备PCR 仪。 台式高速冷冻离心机：可控温至 4，离心力 12000 g 以上全自动组织快速碾磨仪。 涡旋振荡器 冰

4、箱：28、-20、-70 三种。电泳仪。 水平电泳槽。凝胶成像系统 可调微量移液器：最大量程分别为 10 L、50 L、100 L、1000 L。 高压蒸汽灭菌锅 1 DB34/T 42042022电子天平：精确度 0.001 g。 试剂 GB/T 6682，121、20 min DNA 2Easy TaqSuper Mix：商品化试剂。 0.5TBE 缓冲液： 称取 108g Tris 、7.44 g 枸橼酸钠 、55 g 硼酸，溶于 1000 mL 水中，配成 10TBE 缓冲液备用。使用时，取 10TBE 缓冲液 25 mL，加水 475 mL，制成 0.5 TBE 缓冲液。 1琼脂糖：

5、 称取 1 g 琼脂糖 ，溶于 100 mL 0.5 TBE 缓冲液中 。 （PBS）8gNaCl、0.2KCl、1.44Na2HPO40.24gKH2PO4800 mLHClpH1（121204无水乙醇：分析纯。 DNA DNADL2000 Marker 70、 minPCV3 引物序列见表1，委托有资质的公司进行合成。 表1引物序列见表1，委托有资质的公司进行合成。 表13PCR7 样品的采集、运输与保存采集按照 NY/T 541g10EDTA（5mL10mL5mL 灭菌运输与保存2 引物名称引物序列碱基数扩增基因扩增基因片段长度第1轮扩增上游引物（F1） 5-CCACATGCGAGGGC

6、GTTTAC -3 20 Cap 657 bp 第1轮扩增下游引物（R1） 5-CCACAGCTGGCACATACTAC -3 20 第2轮扩增上游引物（F2） 5-CTTTGGTGCCGTAGAAGTCTG-3 21 Cap 412 bp 第2轮扩增下游引物（R2） 5-CGCCTAAACGAATGGGAAAC-3 20 DB34/T 42042022按照 NY/T 541 的规定执行。 组织样品取样品约 1 g 放入 1.5 mL 离心管中，用手术剪剪碎，加入 1 mL PBS进行研磨（研磨管中加入23粒灭菌钢珠），制备组织匀浆，5000 g 离心 15 min，取上清液用于核酸提取。 抗

7、凝血样品直接用于核酸提取。 粪便、口鼻拭子样品充分震荡后，室温静置 5 min10 min，取上清 1 mL 加到 1.5 mL 灭菌离心管中，5000 g 离心15 min，取上清液用于核酸提取。 DNA采用商品化的DNA提取纯化试剂盒，按试剂盒说明书进行操作。也可采取酚氯仿法进行样品DNA提取10 套式 PCR 扩增反应体系配制按照表1配制反应体系，总反应体系体积为 20 10 套式 PCR 扩增反应体系配制按照表1配制反应体系，总反应体系体积为 20 L，配置表见表2。 表2 PCV3 套式 PCR 扩增体系配制表 3 第 1 轮扩增 第 2 轮扩增 组分 用量 （L） 组分 用量 （L

8、） F1/R1 各 0.5（10 mol/L） F2/R2 各 0.5（10 mol/L） 2Easy TaqSuper Mix 10 2 Easy TaqSuper Mix 10 灭菌超纯水 8 灭菌超纯水 8 DNA 模板 1 DNA 模板（第 1 轮扩增产物 50倍稀释） 1 总体积 20 总体积 20 DB34/T 42042022 第1轮PCR955 min 后，35（95 变性 30 s58 退火3072 延伸 30最后 72 延伸 10min，4PCR 电泳将第轮PCR1（DNA100 间 30 min40 min 用凝胶成像系统观察结果，并进行拍照。 11 结果判定检测结果成立

9、条件PCR412 bpPCR（B） 结果判定PCR412bpPCV3在试验成立的条件下，如果检测样品PCR产物电泳后未出现 412 bp 大小特异性目的条带，判为阴性，则该样品为PCV3核酸阴性。 12 实验室废弃物无害化处理病料的无害化处理按照病死及病害动物无害化处理技术规范的规定执行。 实验废弃物处理2 的84消毒液浸泡 30 min 后，放置于危险废弃物容器内暂存，委托有资质的固体废弃物无害化处理机构处置。 4 DB34/T 42042022按照 SN/T 1193 的规定执行。 按照 GB 19489 的规定执行。 5 5 DB34/T 42042022附 录 A（资料性）酚氯仿法提取样品DNA500L10（SDS1080mL， pH100L20mg/mLKK100 mg5 mL）10 L552 h3 。 加入 200 L Tris412000 g15 min A.3 500 L200 L Tris200 L412000 g15 min A.4 400 L200 L4、 1200015 min A.5 取上清 300 L220 静置 20 min，412000 g15 min