细胞表面分子检测和分析

1、关于细胞表面分子的检测与分析第一张，PPT共四十四页，创作于2022年6月流式在细胞表面分子检测中的应用免疫细胞及其亚群的检测与功能分析例如：T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞等血液系统细胞表面标志的研究例如：急性白血病的初步诊断与检测、CD34+造血干细胞研究、血小板分析辅助诊断相关疾病等细胞群体及细胞表面标志变化的监测例如：测定因试验或临床治疗引起的某些细胞表面标志的变化细胞表面标志构成性质的分析例如：蛋白、糖蛋白、类脂结构、性质、比例的分析第二张，PPT共四十四页，创作于2022年6月标本来源实体组织 新鲜组织、石蜡包埋样本骨髓穿刺液 体液、灌洗液外周血 全血溶血、PBMC培养的细胞 原

2、代细胞 细胞系：贴壁细胞、悬浮细胞 第三张，PPT共四十四页，创作于2022年6月一、新鲜实体组织样本的制备 酶消化法。 常用的酶类试剂：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶等 机械法。1、剪碎法 2、网搓法 3、研磨法 化学处理法。 常用试剂：0.2%EDTA 0.25%胰酶+0.2%EDTA注意：除消化过程外，其余步骤最好在4环境下操作，提高 细胞活性。 标本制备第四张，PPT共四十四页，创作于2022年6月 标本制备二、全血标本的制备 “ABC”溶血（Beckman） 取肝素钠抗凝的外周血100ul，荧光标记完成后，依次加入A液600ul，轻轻振荡15s；B液260ul, 轻轻振荡

3、15s；C液100ul, 振荡10s，免洗上机检测。 “ACK”溶血（自配） 以1：3的比例取肝素钠抗凝的外周血与ACK溶血剂混匀，室温放置10min，离心去上清，再加入溶血剂溶血，反复23次，至红细胞完全溶解。细胞重悬后，再进行荧光标记。第五张，PPT共四十四页，创作于2022年6月标本制备三、外周血单个核细胞的制备（1）取外周血2ml，肝素抗凝，生理盐水稀释成4ml，混匀；（2）将装有4ml淋巴细胞分离液的试管倾斜45度，沿试管壁缓慢 加入稀释血液，勿用力过大；（3）离心2000r/min，20min，离心后分层，上层为血浆层，中层 为分离液层，底层为红细胞层；（4）用吸管将上层与中层之间

4、的单个核细胞层吸出，用生理盐水 洗两遍，PBS重悬；（5）荧光标记。第六张，PPT共四十四页，创作于2022年6月四、贴壁细胞单细胞悬液的制备 （1）将培养细胞用0.04EDTA或0.25胰酶消化37分钟， 至光镜下见到贴壁细胞变圆还没有漂浮为止，弃消化 液，加PBS； （2）用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，移入离心管中； （3）离心，1000r/min，5min； （4）加PBS洗两遍； （5）PBS重悬，将细胞吹打均匀； （6）荧光标记。标本制备第七张，PPT共四十四页，创作于2022年6月标记方法直接免疫荧光法 特点：操作简单、省时；特异性强；结果判断较简单。间接免疫荧光法 特点：适用

5、范围广；抗体相对便宜；操作费时；易产生非特异性染色，结果不易判断。（建议只用于单标检测）直接、间接混合染色法 染色原则：一般情况下先间接后直接，特殊情况下可先直 接标记。推荐！第八张，PPT共四十四页，创作于2022年6月对照设置阴性对照 调节荧光探测器放大倍数，确定带测标本的基础荧光域值。常用的有：同型对照、封闭抗体对照、阴性细胞对照阳性对照 检测抗体特异性或确定实验方法的稳定性、准确性。空白对照 确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功。 补偿对照 多色荧光标记时，用于荧光光谱重叠的调节。第九张，PPT共四十四页，创作于2022年6月同型对照（Isotype Control）用于消

6、除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色与染色的单克隆抗体 相同种属来源 相同免疫球蛋白及亚型 相同荧光素标记 相同剂量和浓度 由未免疫动物血清纯化而来第十张，PPT共四十四页，创作于2022年6月双色标记荧光补偿 口诀：横平竖直第十一张，PPT共四十四页，创作于2022年6月荧光补偿对照分析类型管功能 加入的抗体单色分析1Isotype1-FITC2Sample1,2A-FITC双色分析1Isotype1-FITC2a-PE2Compensation1A-FITC2a-PE3Compensation21-FITCB-PE4Sample1,2A-FITCB-PE三色分析1Is

7、otype1-FITC2a-PE1-PC52Compensation1A-FITC2a-PE1- PC53Compensation21-FITCB-PE1- PC54Compensation31-FITC2a-PEC-PC55Sample1,2A-FITCB-PEC-PC5四色分析1Isotype1-FITC2a-PE1-ECD1- PC52Compensation1A-FITC2a-PE1- ECD1- PC53Compensation21-FITCB-PE1- ECD1- PC54Compensation31-FITC2a-PEC- ECD1- PC55Compensation41-FIT

8、C2a-PE1- ECDD-PC56Sample1,2A-FITCB-PEC-ECDD-PC5第十二张，PPT共四十四页，创作于2022年6月注意事项样本的采集、储存样本的染色全血样本的溶血效果流式实验对照的设置第十三张，PPT共四十四页，创作于2022年6月样本的采集手术切除的新鲜标本取材时，要避免出血或组织坏 死。深低温保存，以免组织发生自溶，DNA降解，造成检测结果的误差。采集静脉血样本时，要避免发生溶血。收集培养的细胞时，要注意选择消化的方法和试剂。第十四张，PPT共四十四页，创作于2022年6月样本的储存原则：时间越短越好肝素抗凝的外周血和骨髓：室温 72小时EDTA抗凝的标本：室温

9、 24小时ACD抗凝的外周血：室温 72小时ACD不推荐用作骨髓穿刺液的抗凝粒细胞、血小板功能检测：即刻检测单核细胞表面抗原分析： 1小时，4嗜酸性粒细胞表面抗原分析： 24小时，4淋巴细胞免疫表型与DNA含量的分析： 72小时第十五张，PPT共四十四页，创作于2022年6月样本的染色影响抗原抗体反应的因素 电解质、反应温度与时间 、PH值（7.27.4）流式抗体的选择 根据流式细胞仪的类型选择抗体 抗体应用级别、滴度和使用量的选择 根据抗原表达量选择抗体第十六张，PPT共四十四页，创作于2022年6月 溶血，即裂解红细胞。它是流式细胞术分析白细胞的先决条件。溶血不好，白细胞群不能很好分开，溶

10、血好坏直接影响检测结果。因此，必须对溶血过程进行严格控制。 全血样本：溶血效果很重要影响溶血的因素：采血过程 溶血剂的使用 实验操作过程第十七张，PPT共四十四页，创作于2022年6月第十八张，PPT共四十四页，创作于2022年6月结语流式细胞术的样本制备没有一个黄金标准最佳样本制备方法需要根据具体情况独立设定评估第十九张，PPT共四十四页，创作于2022年6月常用的荧光染料 荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红 PeCy5 488 675 免

11、疫荧光 红 PI 488 620 DNA染色 橙红 PECy7 488 755 免疫荧光 深红 PerCP 488 670 免疫荧光 深红第二十张，PPT共四十四页，创作于2022年6月参考书籍实用流式细胞术彩色图谱王书奎主编 流式细胞术基本原理与实用技术梁智辉主编临床流式细胞分析 王建中主编流式细胞术 杜立颖主编第二十一张，PPT共四十四页，创作于2022年6月实验：人外周血T淋巴细胞亚群的 检测与分析第二十二张，PPT共四十四页，创作于2022年6月淋巴细胞单核细胞粒细胞这三群细胞分别由具有不同功能的细胞组成这些细胞数量不等，甚至非常稀少这些细胞表达不同的标记物，是用来区分它们的基础第二十

12、三张，PPT共四十四页，创作于2022年6月T淋巴细胞(CD3+)名 称功 能CD3+CD4+辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti)辅助和诱导细胞免疫和体液免疫 CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29-辅助性T细胞(Th)诱导性T细胞(Ti)辅助细胞免疫和体液免疫诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD8+抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc)抑制免疫反应/杀伤异源细胞 CD3+CD8+CD28- CD3+CD4+CD29-抑制性T细胞(Ts)杀伤性T细胞(Tc)抑制细胞和体液免疫细胞毒性T细胞CD3+CD4+CD8+活化的T细胞在T细胞恶性增生时升高 CD3+CD4-CD8- 有调节功能的T

13、细胞,其表达 / T细胞受体(TCR / ) CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO- 幼稚的/静止的T淋巴细胞 当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞亚群较低 CD45RA-CD45RO+ 记忆性T淋巴细胞 病菌感染时升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+ 活化的T细胞, 感染时升高 感染时升高第二十四张，PPT共四十四页，创作于2022年6月活化T淋巴细胞名 称功 能CD3+HLA-DR+活化T细胞CD4+HLA-DR+ 活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞CD4+CD25+

14、 活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+ CD25+ CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞在病毒感染的患者中增加; 其增加意味着HIV患者的预后较差B淋巴细胞(19+)CD19+CD23+ 活化的B细胞过敏患者中升高 CD19+CD5+ 在自身免疫性疾病中升高 CD19+CD5+CD23+ 慢性B细胞白血病及单克隆B淋巴细胞 NK细胞CD3-CD(16+56)+自身免疫性疾病时降低, 而病毒感染时升高 CD3+CD57+CMV(巨细胞病毒)感染的强烈征兆 第二十五张，PPT共四十四页，创作于2022年6月 实验分组 同型对照管或空白对照(调节电压) 单标补偿管(电压不变,调节

15、荧光补偿) 双标样本检测管第二十六张，PPT共四十四页，创作于2022年6月1.取4只FCM测量管，编号blank、CD3、CD4、CD3CD4，各管内加入100l新鲜抗凝血；2.直接标记法：各管内加入相应的荧光标记抗人的单克隆抗体 2ul，充分混匀，闭光孵育2030min；3.溶血。ACK溶血剂:加入500l ACK溶血剂，充分混匀，反应10min, 1500r/min离心5min，去上清，PBS洗1次；若红细胞存留较多，再重复溶血一遍。收集细胞上机检测。实验步骤第二十七张，PPT共四十四页，创作于2022年6月ABC溶血剂配方A: 0.12%甲酸 (超纯水配置)B:碳酸钠 6.0g/L ;

16、 氯化钠14.5 g/L ; 硫酸钠 31.3g/L (超纯水配置)C:多聚甲醛 10.0g/L( PBS配置) 第二十八张，PPT共四十四页，创作于2022年6月ACK溶血剂配方150mM(8.025g)NH4Cl 10mM(1.01g) KHCO30.1mM(0.0372g)Na2EDTA调PH至7.2-7.4，定容至1000ml无菌滤膜滤过，4保存第二十九张，PPT共四十四页，创作于2022年6月荧光补偿第三十张，PPT共四十四页，创作于2022年6月“A门”内CD3/CD4的表达第三十一张，PPT共四十四页，创作于2022年6月“A门”位置变化引起的改变第三十二张，PPT共四十四页，创

17、作于2022年6月“A门”位置变化引起的改变第三十三张，PPT共四十四页，创作于2022年6月第三十四张，PPT共四十四页，创作于2022年6月小鼠脾细胞CD3+/CD4+的表达第三十五张，PPT共四十四页，创作于2022年6月流式检测胞内细胞因子步骤 1、肝素钠抗凝血1ml+1ml不完全1640培养液混匀，铺24孔板1孔。2、PMA（终浓度100ng/ml）+Ionomycin（终浓度1g/ml），375%CO2刺激2h。3、2h后加入阻断剂Monensin（终浓度2.5mol/ml）混匀，继续培养4h。4、培养结束后，1500rpm*5min离心去上清。5、表面分子染色。取7只流式检测试管

18、，每管中加入100l压积血，按下列表格内容加入抗体染色，4避光染色30min。 管号检测内容 荧光抗体 1空白对照无2荧光补偿管FITC-CD3 5l 3荧光补偿管PE-CD8 5l 4荧光补偿管Pecy5-CD8 5l 5荧光补偿管APC-CD3 5l 6同型对照APC-CD3 ;Pecy5-CD87测试管APC-CD3 ;Pecy5-CD8第三十六张，PPT共四十四页，创作于2022年6月6、 溶血。各管内加入1ml BD溶血剂，混匀，室温避光静置10min，1500rpm*5min离心去上清。SB染色缓冲液1ml/管洗一次，1500rpm*5min离心去上清，混匀沉淀细胞。7、 固定。各

19、管内加入500l 2%PFA固定剂，4避光固定30min。1500rpm*5min离心去上清。SB染色缓冲液1ml/管洗两次，1500rpm*5min离心去上清，混匀沉淀细胞。8、 透膜。各管内加入500l 透膜液，4避光1015min。1800rpm*5min离心去上清。9、 封闭。6、7号管加入25l封闭液。（5l小鼠血清+20l 10%BSA)4避光30min。10、 胞内染色。6号管内加入同型对照抗体FITC-mIgG1和PE-mIgG1各2l； 7号管内加入抗体FITC-IFNg和PE-IL17各5ul。4避光染色30min后透膜液500l/管洗一次,SB染色缓冲液 1ml/管再洗一

20、次。11、上机检测。2%PFA固定剂300l/管混匀重悬4放置待检。第三十七张，PPT共四十四页，创作于2022年6月第三十八张，PPT共四十四页，创作于2022年6月流式检测外周血Treg细胞步骤1、采集静脉血2ml于肝素钠抗凝管内。2、表面分子染色。取7只流式检测试管，每管中加入100l抗凝血，按下列表格内容加入抗体染色，4避光染色30min。 管号检测内容 荧光抗体 1空白对照无2荧光补偿管FITC-CD4 5l 3荧光补偿管PE-CD4 5l 4荧光补偿管Pecy5-CD3 5l 5荧光补偿管APC-CD3 5l 6同型对照Pecy5-CD3; FITC-CD4;PE-mIgG17胞内同型对照Pecy5-CD3; FITC-CD4;PE-CD258测试管Pecy5-CD3; FITC-CD4;PE-CD25第三十九张，PPT共四十四页，创作于2022年6月3、溶血。 各管内加入1ml BD溶血剂，混匀，室温避光静置10min，1500rpm*5min离心去上清。SB染色缓冲液1ml/管洗一次，1500rpm*5min离心去上清，混匀沉淀细胞。4、固定。各管内加入500l 2%PFA固定剂，4避光固定30min。1500rpm*5min离心去上清。SB染色缓冲液1ml/管洗两次，1500rpm*5min离心去上清，混匀沉淀细胞