DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

1、Aptamer的稳定性考察一聚丙烯酰胺凝胶电泳Aptamer识别肿瘤细胞若选择4C识别，则需要提前控温离心机，且样品在上样检测前宜放置于冰中；37C就不用控温了。Aptamer浓度：荧光标记的是50uM,没有标记的是1OOuMDNA提取注意实验中戴好橡胶手套，穿好实验服，以防苯酚粘到皮肤上。取7.3ulaptamer（100uM）于1460ul小鼠血清（无需过滤）中，在37C细胞培养箱中孵育；于不同时间点（6h,5h,4h,3h,2h,1h,1min）取200ul该小鼠血清到新的EP管中，加入200ul（等体积）的苯酚-氯仿（取苯酚-氯仿之前先将苯酚-氯仿混匀），混匀，管中溶液变浑浊；用150

2、00转/分离心10分钟，管中出现3层：上清、白色变性蛋白层、苯酚层；取上清到新的EP管中。在原EP管（变性蛋白层和苯酚层）中加入200ulTE溶液，混匀（该步进一步提取残留的DNA）；用15000转/分离心10分钟，收集上清；重复4、5步直到上清澄清；在上清中加入等体积的氯仿（用于去除苯酚），混匀，用15000转/分离心10分钟，取上清到新的EP管中；加入等体积乙醚（用于去除氯仿），混匀后静置10分钟，弃上层乙醚（乙醚比水轻，在上层）；重复步骤8，敞开管盖15分钟，待乙醚挥发；加入1/10体积的3MNaAc、2倍体积的无水乙醇，放置于-20C冰箱中30分钟（DNA沉淀）；用16500转/分（转

3、速不宜再高，EP管容易破裂！）离心30分钟；将管中溶液吸出，转移至新的EP管中。原管中保留约30ul溶液，打开管盖，待管中溶液蒸发；（我通常将EP管敞开，封上封口膜，再扎7、8个孔，放在通风橱中过夜。）（管底看不到沉淀，因为DNA含量太低。）在管中加入16uL1*TE溶液；进行电泳分析前，将样品在95C水浴中加热10分钟（小心管盖冲开或进水），在冰上骤冷（使DNA成单链）,上样或保存在-20C冰箱中。聚丙烯酰胺凝胶电泳注意实验中戴好手套！准备：清洗干净玻璃板、凉干！装好电泳的玻璃板（用1.5mm的厚玻璃板）；有凹槽的一面向内！压紧，避免漏液！配胶：20%变性聚丙烯酰胺凝胶8ml：称取尿素3.3

4、6g,加入45%丙烯酰胺溶液3.56ml,5XTBE1.6ml,加热使尿素溶解（可用55C水浴加热），通过10ml量筒加水至8ml,轻混匀后放在冰上冷却（溶液温度较高时，加入催化剂后将迅速凝胶，甚至来不及灌胶），加入3-6ulTEMED（助催化剂）、10%过硫酸铵60ul（催化剂）。催化剂过多可能导致来不及灌胶就凝胶！3灌胶：加入TEMED和过硫酸铵后，用tip头轻搅混匀，迅速灌胶；灌胶应当一次性、顺畅地完成，避免形成断层！插上梳子,约30分钟成胶（观察梳孔间的凝胶情况）；垂直小心地拔出梳子，小心产生气泡；拿掉玻璃板底下的防漏胶带！重新装好玻璃板！注意有凹槽的一面向内！用超纯水、1XTBE溶液

5、冲洗加样孔（很重要，若没有清洗干净，将影响电泳）；加满整个梳孔后用滤纸吸干即可。将电泳槽及电泳装置灌满1*TBE缓冲液（盖过凝胶）；上样：取8ul样品和2ulloadingbuffer混匀，用10ul微量注射器加样（方便伸入加样孔）；&电泳：先用40V电压电泳1小时，再用80V电泳约3-4小时，至溴酚兰带（loadingbuffer中一般含有2种指示剂，跑的较慢的青兰色是二甲苯氰，跑的较快的蓝色是溴酚兰）跑至胶的1/2-2/3，停止电泳；（在不同浓度的胶中，溴酚兰电泳的速度可与某长度的核酸相当，参见我电泳的资料或者李伟师姐的实验书）；电泳过程中会产热而影响电泳效果，可以将电泳装置置于冰盒中，注

6、意保持水平！染色：小心取出凝胶，放在合适的培养皿中，用1XSYBRGold（至少30ml）避光、在摇床中染色20分钟（室温还是？）（第2次染色30min，第3次40min，建议SYBRGold最多重复利用3次。）成像：用凝胶成像系统成像。开机密码：123456。溶液的配制Bindingbuffer在D-PBS中加入：葡萄糖+MgCl2+BSA（在307超高速离心机旁冰箱的柜门中间栏）；混匀后取部分加入10%胎牛血清；剩下溶液中加入10%NaN3（在307超高速离心机旁冰箱的4C最上层的左边最里面），混匀，为Washingbuffer。苯酚-氯仿Tris饱和苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1配制

7、方法：将Tris-Hcl平衡酚与等体积的氯仿/异戊醇（24:1）混合均匀后，移入棕色瓶4C保存。45%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺：43.4g加水定容100ml,用一次性滤头过滤，保存于棕色瓶中。N,N-亚甲基双丙烯酰胺：1.6g（可加热至37C促进溶解）（丙烯酰胺单体具有很强的神经毒性，可通过皮肤吸收且具有累积效应，配制过程中应严格戴手套实验服；聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作。）O.5MEDTA，50ml称取NazEDTAQO（372.24g/mol）9.306g,加水40ml后边搅伴边加NaOH（浓NaOH或者固体NaOH1g左右！）调pH值至8.0（EDTA将逐渐溶解，若pH值到&0后仍有少量不

8、溶，可适当加热），定容至50ml。高温高压灭菌，室温保存。5XTBETris：27g硼酸：13.75g加水至500ml。（用橡胶塞做瓶盖）0.5M的ETDA（pH8.0）：10ml（5*TBE是配胶时用的，电泳时所用的缓冲液是1*TBE浓度！）0.05M的Tris-HCl，pH8.0，100ml称取Tris0.6057g，加水至80ml后，用浓HCl调pH值至8.0，定容至100ml。高温高压灭菌，室温保存。1*TE溶液，pH&0,100ml0.05MTris：20ml加水至100ml。高温高压灭菌，室温保存。0.05MTris：20ml加水至100ml。高温高压灭菌，室温保存。0.5METDA：200ul3MNaAc,pH5.2,50ml称取NaAc3H20(136.08g/mol)20.412g,用冰醋酸调pH值至5.2,定容至50ml,高温高压灭菌后使用，室温保存。SYBRGold染色前配制取10000XSYBRGold(n)ul,加入到(10n)ml1XTBE溶液中，