乳腺癌组织中耐药相关标志基因表达的研究

1、PAGE PAGE 12乳腺癌组织中耐药相关标志基因表达的研究刘新兰1, 崔洁2,马志兰3 (宁夏医科大学附属医院：1肿瘤内科，2医学实验中心，3宁夏医科大学，宁夏 银川 750004)摘 要 目的 探讨乳腺癌组织中多药耐药基因（MDR1）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）、肺耐药蛋白（LRP）基因的表达情况，分析它们与临床病理特征及与雌激素(ER)、孕激素（PR）和原癌基因CerbB2之间的相关性。方法 采用RT-PCR方法检测了42例乳腺癌组织及相应癌旁组织中MDR1、BCRP、LRPmRNA的表达情况。结果 = 1 * GB3 MDR1、BCRP、LRPmRNA在乳腺癌组织中的阳性表达率分别为

2、40.47%，38.09%及61.90，癌旁组织中的阳性表达率分别为19.05%、16.67%和30.95%；两组比较均有显著性差异（P均0.05）；在乳腺癌组织中相对表达量分别为0.810、170.780及140.790.13，癌旁组织相对表达系数分别为0.330.110、0.450.09及0.360.10,三种耐药基因在两组织中相对表达系数差异均有统计学差异（t值分别为4.613、4.850、8.089 P均0.01）。 = 2 * GB3 MDR1 mRNA与乳腺癌患者临床分期及腋窝淋巴结转移呈正相关（P=0.016，0.009, r =0.369,0.3369 ）（P0.05及P0.0

3、1）；BCRPmRNA表达与腋窝淋巴结状况呈正相关（r= 0.355，P=0.021）(P0.01）,与临床分期无相关性（P0.05）；LRPmRNA表达与临床分期、腋窝淋巴结状况之间均无相关性（P0.05）；仅MDR1mRNA表达与C-erbB-2表达呈正相关，（ r=0.311，P=0.045）(P0.05），其它指标间均无相关性（P0.05）。结论 MDR1、BCRP、LRP这三种耐药基因均参与了乳腺癌多药耐药的形成，MDR1、BCRP 的表达可作为预测乳腺癌生物学行为的一个参考指标。关键词 乳腺癌；耐药基因；基因表达；逆转录聚合酶链反应中图号 R730.51 文献标识码 AStudie

4、s on expression of drug-resistance genes associated marker in breast carcionma LIU Xinlan, CUI jie, MA Zhilan (1Department of Oncology，2Department of Medical Experiment Centre,Affiliated Hospital of Ningxia Medical University,3 Ningxia Medical University ,Yinchuan, 750004,China) ABSTRACT Objective T

5、o investigate the expression and significance of the Multidrug resistance gene1,breast cancer resistance protein, lung cancer resistance protein mRNA in the breast cancer tissue and paratumor breast tissue. Methods To exam the expression of MDR1、BCRP、LRPmRNA breast cancer tissues and paratumor tissu

6、es by RT-PCR, and ER、PR及CerbB-2 in breast cancer tissues by IHC .Results The positive expression rate of MDR1、BCRP、LRPmRNA were 40.47%，38.09% and 61.90% in breast cancer tissues.There were significantly different in the cancer tissues and adjacent tissues（respectively ,19.05%、16.67%和30.95%19.05%）; r

7、elative coefficient was 0.810、170.780及140.790.13 in breast cancer tissues.There were significantly different in the cancer tissues and adjacent tissues （t=4.613、4.850、8.089, P 0.01）The expression of MDR1mRNA had a positive correlation with tumor stage groups and axillary lymph metastasis （P=0.016，0.

8、009, r =0.369,0.3369 ）（P0.05及P0.01）；. The expression of BCRPmRNA was significantly different in groups with or without lymph nodemetastasis （r= 0.355，P=0.021）(P0.01）.Expression had a positive correlation with MDR1 and C-erbB-2 in breast tissues （ r=0.311，P=0.045）(P75%为4分；上述二项积分相加，01分为()，23分为()，45分为(

9、+)，67分为(+)；()和()判为阴性，(+)和(+)判为阳性。1.4统计学处理 采用SPSS11.5统计分析软件包进行统计分析，阳性率间比较采用卡方检验；其相对系数呈正态分布，用均数标准差表示，3种耐药基因表达与乳腺癌患者临床病理因素及ER、PR、Cer-B2的相关性采用Spearman等级相关分析，并进行多因素logistic回归分析，以P0.05为差异具有统计学意义。2 结果2.1 MDR1mRNA、BCRPmRNA和LRPmRNA在乳腺癌及癌旁组织中的表达42例乳腺癌患者癌组织中MDR1mRNA、BCRPmRNA和LRPmRNA的阳性表达率与癌旁组织相比，均有显著性差异（2分别为 4

10、.613，4.850，8.089，P0.05）（见表1，附图2）表1 三种耐药基因在乳腺癌组织及癌旁组织中表达水平的比较组别例数MDR1mRNABCRPmRNALRPmRNA阳性数（%） 相对系数阳性数（%） 相对系数阳性数（%） 相对系数癌组织癌旁组织424217（40.47）8#（19.04）0.810.170.330.1116（38.09）7#（16.67）0.780.140.450.0926（61.90）13#（30.95）0.790.130.360.102.2 RT-PCR方法检测MDR1mRNA、BCRPmRNA和LRP mRNA的基因片段测序鉴定 MDR1mRNA、BCRPmRN

11、A和LRP mRNA阳性表达产物经基因测序鉴定结果与Genebank报道序列100%相符（分别见附图3-5）2.3 MDR1mRNA、BCRPmRNA和LRPmRNA与乳腺癌临床病理因素的关系 Spearman 等级相关分析显示，乳腺癌患者中MDR1mRNA阳性表达与病理类型及TNM分期呈正相关(P 分别为0.029，0.016, r 分别为0.336；0.369 )(P0.05)，与腋窝淋巴结状况呈完全正相关（P 为0.009，r 为0.398）（P0.01），与肿瘤大小之间无相关性（P =0.076，r =0.277 )(P0.05）。浸润型乳腺癌、TNM分期增高者及腋窝淋巴结转移者多见M

12、DR1mRNA表达阳性。BCRPmRNA阳性表达与腋窝淋巴结状况呈完全正相关（P =0.021， r=0.355）（P0.01）；BCRPmRNA表达与肿瘤大小、临床TNM分期、病理类型之间均无相关性（P 分别为0.475，0.587,0.387, r分别为0.113,0.086,0.137）(P0.05）。 LRPmRNA阳性表达与肿瘤大小、临床TNM分期、病理类型、腋窝淋巴结状况之间均无相关性（P 分别为0.401，0.352,0.557,0.702, r分别为0.133,0.147,0.093,0.061）(P0.05）。（见表2）表2 三种耐药基因表达与乳腺癌临床病理因素的关系组别例数

13、MDR1mRNABCRPmRNALRPmRNA阳性数(%)相对系数阳性数(%)相对系数阳性数(%)相对系数肿瘤大小2cm82(25.00)0.890.323(37.50)0.810.324(50.00)0.910.322-5cm 2712(44.44)0.790.229(33.33)0.870.2218(66.67)0.890.325cm73(42.85)0.800.124(57.14)0.890.324(57.14)0.890.22临床分期101(10.00)0.790.213(30.00)0.890.345(50.00)0.880.32II219(42.85)0.810.329(42.86

14、)0.800.3214(66.67)0.890.24III85(62.50)0.890.322(25.00)0.890.354(50.00)0.810.32IV32(66.67) 0.820.222(66.67)0.790.323(100)0.890.11腋LN状况阳性2213(59.09)0.830.1212(54.54)0.890.2213(59.09)0.890.32阴性204(20.00) 0.830.324(20.00) 0.820.3213(65.00)0.890.17病理类型浸润型3210(31.25)0.890.1911(34.37)0.890.2419(59.37)0.890

15、.12非浸润型107(70.00) 0.890.225(50.00)0.900.327(70.00)0.900.32为P0.05 为P0.013.3 MDR1mRNA、BCRPmRNA和LRPmRNA与ER、PR及C-erbB-2的关系42例乳腺癌患者中，MDR1mRNA阳性表达与C-erbB-2呈正相关(r 为0.311, P 为0.045)（P0.05)，与ER及PR之间均无相关性(r 分别为-0.243 ，-0.262 ，P 分别为0.122，0.093)（P0.05）。BCRPmRNA阳性表达与ER、PR及C-erbB-2之间均无相关性(r 分别为-0.294 ，-0.220 ，0.7

16、8,P 分别为0.059，0.161,0.075)（P0.05）LRPmRNAy阳性表达亦与ER、PR及C-erbB-2间无相关性（r 分别为-0.000 ，-0.075 ，0.132,P 分别为1.000，0.637,0.406)(P0.05）（见表3）表3三种耐药基因表达与乳腺癌ER、PR及C-erbB-2的关系组别 例数MDR1mRNA BCRPmRNA LRPmRNA阳性数(%)相对系数阳性数(%)相对系数 阳性数(%) 相对系数ER阴性2111(52.38)0.790.3211(52.38)0.890.22 13(61.90) 0.890.32阳性216(28.57)0.890.32

17、5(23.81)0.910.320.910.32 13(61.90) 0.890.22PR阴性2312(52.17)0.900.2711(47.83)0.750.12 15(65.22) 0.900.12阳性195(26.32)0.890.325(26.32)0.770.32 11(57.89) 0.790.32C-erbB-2阴性153(20.00)0.910.323(20.00)0.760.12 8(53.33) 0.890.15阳性2714(51.85) 0.840.2713(48.15)870.32 18(66.67) 0.880.32为P0.05 3.4 多因素logistic回归分

18、析结果分别以MDR1、BCRP和LRPmRNA为因变量，以上述各项临床病理因素及ER、PR和 C-erbB-2为自变量，logistic多因素分析显示，腋淋巴结及C-erbB-2这2个自变量指标进入MDR1和BCRPmRNAL回归方程，腋窝淋巴结状况及C-erbB-2与MDR1mRNA的表达相关（P0.01）；，腋窝淋巴结状况与BCRPmRNA的表达相关（P0.01），表明MDR1和BCRPmRNAL预测乳腺预后的高危因素，方程分类能力显示MDR1和BCRPmRNAL预测乳腺预后的准确率分别为78.60%和66.70%，而所有自变量指标均未进入LRPmRNA回归方程，表明其表达与临床病理因素及

19、ER、PR和 C-erbB-2均无关（P0.05），提示LRPmRNA与乳腺癌预后无关。（见表4、5）表4乳腺癌患者MDR1mRNA表达的多因素logistic回归分析变量回归系数b标准误SbWaldP值OR值回归方程检验分类能力2P值腋LN状况C-erbB-22.952.311.021.048.354.920.0040.02719.1810.0869.00%78.60%6.9115.980.0090.000表5乳腺癌患者BCRPmRNA表达的多因素logistic回归分析变量回归系数b标准误SbWaldP值OR值回归方程检验分类能力2P值腋LN状况2.270.857.160.0079.646

20、6.70%5.490.0193 讨论多药耐药的产生是化学药物治疗肿瘤失败的一个主要原因，是乳腺癌综合治疗的瓶颈。克服肿瘤细胞多药耐药性，提高抗癌药物疗效已成为肿瘤全身治疗亟待解决的关键性课题。最常见的机制之一是肿瘤细胞胞膜ATP依赖性转运蛋白-由多药耐药基因MDR1编码的P-糖蛋白，细胞膜ATP依赖性转运蛋白超家族成员-乳腺癌耐药蛋白(BCRP)的过度表达。二者均是跨细胞膜的糖蛋白，当肿瘤细胞膜上过度表达这些膜蛋白时，这些膜蛋白将结合抗肿瘤药物，同时其ATP结合位点结合ATP，ATP水解后释放的能量使药物泵到胞外，使细胞内的药物浓度维持在较低水平，肿瘤细胞从而获得耐药性。目前对BCRP基因与乳

21、腺癌耐药关系的结果不一致1，2。肺耐药蛋白(LRP)作为穹隆体的主要蛋白成分，它通过调节细胞浆与细胞核之间的物质转运及细胞浆之间的囊泡运输而介导耐药，参与了非糖蛋白介导的多药耐药机制。本研究结果显示，乳腺癌组织及癌旁组织中均存在一定量的MDR1、BCRP、LRPmRNA表达，其阳性表达率在二者间差异有显著性。提示MDR1、BCRP、LRPmRNA为存在于正常乳腺组织细胞膜的一种跨膜蛋白，与乳腺腺叶细胞的分泌及外排功能有关，当乳腺组织发生病变时其表达水平增高，在癌组织中它的表达可能得到了加强，而且本课题所有患者均未经过化放疗等抗肿瘤治疗，说明乳腺癌具有原发型耐药, MDR1、BCRP、LRP这三

22、种耐药基因通过不同的耐药机制参与了乳腺癌多药耐药的形成。在本实验中经Spearman等级相关分析结果表明，MDR1mRNA表达与病理类型、TNM分期及腋窝淋巴结转移呈正相关，浸润型乳腺癌随TNM分期增高及腋窝淋巴结转移者MDR1mRNA阳性表达越高。BCRPmRNA表达与腋窝淋巴结转移呈正相关，而与肿瘤大小、TNM分期及病理类型之间无相关性,与王晔3-5等研究结果一致。腋窝淋巴结转移是目前已经公认的乳腺癌患者预后不良的独立因子，多因素logistic回归分析显示，腋窝淋巴结状况与MDR1mRNA和BCRPmRNA的表达相关,提示MDR1和BCRP基因的表达水平可能作为乳腺癌侵袭的标志，是判断乳

23、腺癌患者生物学行为的指标之一。Rybarova4，6研究揭示在乳腺癌组织中LRP表达与乳腺癌的病理类型及淋巴结转移无相关性。本实验研究亦显示，LRPmRNA及其产物表达与肿瘤大小、TNM分期、腋窝淋巴结状况及病理类型之间无相关性。结合多因素logistic回归分析表明LRP在乳腺癌组织中虽有较高的阳性表达率，但不能作为判断乳腺癌的恶性程度和病情进展程度的指标。乳腺癌的发生、发展与激素水平关系密切,在乳腺癌组织中ER、PR的高表达，被视为乳腺癌患者内分泌治疗的评价指标7-9。原癌基因C-erbB-2在乳腺癌的发生发展中起重要作用，是乳腺癌的重要预后指标之一8。目前研究发现20-30%的乳腺癌有C

24、-erbB-2过表达，该类患者预后差。本实验结果表明MDR1mRNAp的表达与ER和PR无相关性，与Rybarova3的研究结果相同。提示在乳腺癌中MDR1mRNA的表达，不能用来指导内分泌治疗。但乳腺癌组织中MDR1mRNA的表达与C-erbB-2的表达呈正相关，与大多数3,11研究结果相同，提示MDR1mRNA阳性表达者侵袭性强，预后差，可能作为预测乳腺癌患者预后的因素。而BCRPmRNA和 LRPmRNA2表达与ER、PR及C-erbB-2之间均无相关性。与Rybarova4，12 等报道一致。提示二者未参与ER、PR作用的环节，不能作为指导内分泌治疗的指标。综上所述，乳腺癌中存在着广泛

25、的原发性多药耐药现象，MDR1、BCRP、LRP均参与了乳腺癌多药耐药的形成，MDR1和BCRP基因的表达水平可能作为乳腺癌侵袭的标志，是乳腺癌患者判断生物学行为的指标之一。参考文献:1 Atsuko kanzaki,Masakazu Toi,kentaro Nakayama et al.Expression of mulitidrug resistance-related tansporters in human breast carcinoma.Jpn J Cancer Res，2003，92（4）：452-458.2 Herman B,John AF,Maxime PL.RNA expr

26、ession of breast cancer Resistance Protein,Lungresistance-relatedprotein,mulridrugresistance-associated protein 1 and 2,and multidrug resistance gene 1 in breast cancer:correlation with chemotherapeutic response.Clin Cancer Res,2003,2(9):827-836. 3 王晔，宋科瑛，王建丰，等. 乳腺浸润性导管癌中P-gp和C-erbB-2的表达及临床意义J. 中国临床

27、医学，2008，15 (5)：725-727.4 S Rybarova, I Hodorova, M Hajdukova, et al.Expression of MDR proteins in breast cancer and its correlation with some clinical and pathological parameters J. Neoplasma, 2006；53(2)：128-135.5 刘新兰，王程，陈萍. 乳腺癌组织中多药耐药相关基因产物表达的研究J. 宁夏医学院学报，2008，30（4）：418-420.6 王文静，王明玉，等，LRP与MRP在乳腺癌组织中的表达及意义J. 山东医药，2007，47（20）：4-6. 7 J.Martin de Las Mulas J，Millan Y，Dios R. A prospective analysis of immunohistochemically determined estrogen receptor(alpha) and progesterone receptor expression a