超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术

1、实训三超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术一、实验原理：通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除 盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。二、实验材料与方法：一材料:绿豆种子，市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用.二试剂:葡聚糖（sephadexG-100 或 G150）, NaCl（AP）,磷酸氢二钠（AP）, 磷酸二氢钠（AP）,三羟甲基氨基甲烷（Tris）,盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）, PEG6000,考马斯蓝G250 ,磷酸，乙醇（AP），牛血清蛋白BSA ,连苯三酚 （焦性没食子

2、酸）,甲硫氨酸（methionine） , NBT （氮兰四唑Nitroblue Tetrazdinna）,核黄素，EDTA（钠盐），超氧化物歧化酶（sigma公司），三 仪器：离心机WFZ-UV2000型紫外分光光度计201X7 （717）强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂匀浆机、各型号烧杯、试管、量筒、带毛塞试管、漏斗、移液枪、移液管、 玻璃棒、四实验方法和步骤：称量25g绿豆+250ml pH7 0.05 mol/L pb液，匀浆，两层纱布过滤，离心（3000rpm） 15Min取清液，取少量样为样，测量SOD活性、蛋白质含量 测量，计算SOD总活性单位及活性单位。所得清液测量总体积，缓慢40

3、%饱和（NH4）2SO4至浓度为19.4g/100ml，4C 冰箱静置分层。离心（3000rpm）取清液，取少量为样，测量SOD活性、蛋白质含量测 量，计算SOD总活性单位及活性单位。步骤3中的清液缓慢加入硫酸铵至75%饱和度（8.7g/100ml）（过程充分搅拌）， 5C至分层，离心（3000rpm）取沉淀，取样，计算SOD总活性单位及活 性单位。装入透析袋中，于蒸馏水中5C透析过夜。透析后溶液用滤纸过滤得清液，重新装入透析袋中用PEG浓缩。装柱：1）排气加蒸馏水一留15%体积水2） 100mL G100 一次装完3）静置10min 打开出液口 一 排过量洗脱剂4）保留离胶面2-3cm接洗脱

4、瓶 一平衡30min 理想流速注意胶面始终保持水层洗脱瓶：pH7, 0.02MPb层析过程样品：浓缩y 一离心一 过滤一 J体积31mLI取样上样：5 %上样量2 3mol洗脱:1mL/min,3mL/ 支，共收 100120mL*测（1） a280值（2）SOD活性（粗略）20支管 每支3mL（3）搜集活性峰并测酶活性9.比活力、得率及纯化倍数计算：SOD的比活力按下面公式计算:%。的比活力=酶液活力WL）酶液蛋白含量3幻,部）三、结果与讨论一 SOD活性及蛋白质测定结果：蛋白质含量测定：表1.牛血清制作蛋白质标准曲线（牛血清单位为 0.1mg/ml）蛋白质（mg） 0001 0020030

5、040.050图1.牛血清制作蛋白质标准曲线（牛血清单位为0.1mg/ml）二 硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩过程表2.连苯三酚测样品SOD活性（A325）连苯三 酚/ul酶/ulA样50500.021样55200.025样57480.033表3.考马斯蓝G-250测样品蛋白含量（A595）:样品体积/ul第一次测量第二次测量OD平均值（nm）样100.5660.5580.562样100.2910.2930.292样1200.1150.1200.118根据蛋白质标准曲线求出蛋白质含量：样 0.067mg样 0.035mg样 0.016mg（三）葡聚糖凝胶层析分离纯化SOD实验结果表4.葡聚糖G

6、100凝胶层析洗脱曲线（以A280吸收作为蛋白质含量的相对值）试管号吸光值（nm）(1 0.059(20.079(30.019(4 0.083(5 0.048(6) 0.044(7) 0.04试管号(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)吸光值（nm）0.0240.0210.030.0170.0310.0230.018试管号（15）（16）（17）(18)(19)(20)吸光值（nm）0.0190.0110.0130.0180.0200.023图2.葡聚糖Sephadex G100凝胶层析分蛋白质洗脱曲线经连苯三酚粗测，（3）号管颜色最浅，而根据蛋白质洗脱曲线看出（3）号管 位于蛋

7、白质含量峰上，所以选取（3）号管作为目的试管收集SOD，测量其准确 SOD活力和蛋白含量，计算SOD比活力。表6.考马斯蓝G-250测收集试样的蛋白含量（A595）：豆液稀释倍数第一次测量第二次测量平均值（nm）-试管 30.1210. 1150.118计算得：加入酶量相当的酶活力单位(unit)= (AA-AA) /AA*2样 (0.078-0.021)/0.076*2=1.51样 (0.063-0.025)/0.063*2=1.21样 (0.074-0.041)/0.074*2=0.89试管 3 (0.074-0.054)/0.074*2=0.54提取液的总活力(unit)=加入酶量相当的

8、酶活力单位* (反应液总体积/取样液体 积)*稀释倍数样 1.51* (219/0.050) =6613.8样 1.21* (221/0.055) =4862样 0.89* (50/0.048) =929.05试管 3 0.54* (3/0.065) =24.92SOD总得率为：总得率=最后样品活率/样1活率*100%=24.92/6613.8*100%=0.3768%SOD的比活力为=总活力(units) /总蛋白量(mg)样 6613.8/1467.3=4.51样 4862/773.5=6.29样 929.05/80 =11.61试管 3 24.92/2.95=8.45纯化倍数=比活2/比

9、活16.29/4.51=1.4014.45/4.51=3.208.45/4.51 =1.87（四）实验总结及讨论:根据以上数据，计算各步提纯中酶的总活力:A325加样体积（ml总体积（ml）总活力（U）样0.0310.052216613.8样0.0250.0552194862样0.0410.05750929.05试管（3）0.1430.30324.92总蛋白含量计算:取样蛋白质含量稀释倍数加样体积（ml）总体积（ml）总蛋白含量（mg）(mg)样0.0670.012191467.3样0.0350.01221773.5样0.0160.015080试管（3）0.1180.1232.95纯化步骤总活

10、力（U）总蛋白（mg）比活(U/ mg pro.)纯化倍数粗酶液（样）6613.81467.34.5140%硫酸铵盐析（样）4862773.56.291.40透析后（样）1156.258014.453.20葡聚糖凝胶层析（试管3）76.2092.958.451.87试管号化步骤活变化o o O o o O 0 8 6 化步骤活变化o o O o o O 0 8 6 TX00400o21600图3.各纯中SOD总酶1400趋势1200图4.各纯化步骤中SOD总蛋白含量变化趋势图5.各纯化步骤中SOD比活变化趋势1.可以看出，在25g绿豆中随着不断的分离提纯，总活力不断减小，比活力不断 上升，最后

11、总纯化倍数为1.87，活性得率为0.3768%，没有达到预期效果。为什么要从植物中提取SOD？初步验证阶段。国外SOD主要应用于医疗、保健方面，有以动物血液及内 脏为原料制取SOD的报导，但存在着成本高、含有致热因子等缺陷，因此，适 用范围极为有限。尤其是近年来受“疯牛病”的影响，许多国家和地区抵制以动 物血液及内脏为原料制取的超氧化物歧化酶，使得超氧化物歧化酶在国际市场上 极为紧缺。从植物，特别是人们日常经常食用的蔬菜、瓜果、野生植物及粮食中提取SOD， 使用安全性非常高，避免了可能发生的交叉感染。利用全新的生物技术从植物中 提取SOD，具有明显的社会和经济效益，市场前景广阔。从植物中提取SOD的 主要工艺流程为:植物一打浆一超滤分离一有机溶剂去杂一柱层析精制一超滤浓 缩一冷冻干燥一产品用Tric-HCl而不用磷酸缓冲液的原因因为反应物连苯三酚在酸性条件下稳定，在碱性条件下能自氧化。而SOD 活力的测定是依