超临界CO2萃取天然产物

1、使用超临界二氧化碳从向日葵叶提取具有生物活性的天然化合物L. Casasa, C. Mantella, M. Rodrf gueza, A. Torresb, F.A. Macf asb, E. Martf nez de la Ossaa化学工程系，食品技术和环境技术，科学学部，University of Cadiz, Box 40, 11510 Puerto Real, Cadiz,西班牙摘要超临界二氧化碳在提取油葵（向日葵）生物活性化合物的应用中进行了研究。 含有不同的变量，包括前处理的样品，温度和压力。将样品干燥或凝结的提取条 件如下：35，40，45和50C的温度下，压力为100，20

2、0，300，400和500bar。 使用干燥后的样品，在温度为50C和压力为500bar达到最好的萃取率。根据不 同的条件集合得到的提取物的生物活性进行了比较。关键词 向日葵；天然产物超临界二氧化碳萃取；生物活性化合物1引言天然产物的复杂性往往需要最大效能的从样品制备、分离和鉴定使用方法。 天然产品往往是通过以下常规方法提取和分离技术获得，如使用有机溶剂提取物 质和柱色谱法，高速液相色谱（HPLC ）纯化法。这些技术涉及使用环境不友好的有机溶剂，常规的分离方法通常是繁琐，费 时，需要多个步骤，更糟的是，样本被不可逆地吸附到固定相。在天然产物领域 微波辅助萃取、加速溶剂萃取法和超临界流体萃取（S

3、FE）新技术利用少量的有 机溶剂。超临界二氧化碳可以替代不具有任何相关的传统的有机溶剂1的负面影 响。在最佳条件下，超临界流体萃取提供有效，重复性好，快速萃取2。这种技 术已被证明产生比索氏提取，超声处理，加速溶剂萃取同等或更好的结果。超临界条件下二氧化碳提取在环境影响方面构成一个新兴的技术。在使用二 氧化碳的优点包括其无毒性，化学惰性，成本低和随时可用的。此外，使用二 氧化碳也有利于提高获得的产品品质，因为这种技术并不引起过度加热，加热对 热不稳定的化合物通常具有负面影响。使用二氧化碳超临界流体萃取代替有机溶 剂，二氧化碳具有不寻常的性能，如高的可压缩性，液体状的密度，高扩散性， 低粘度和低

4、表面张力。其结果是，超临界流体中显示了比常规的有机溶剂从复杂 基质的材料更大的超细矩阵扩散能力，从而提高了提取率。由于众多的参数：提 取时间，压力，温度，流量，攻丝技术和超临界流体组合物，其他萃取方法相比， 超临界流体萃取过程的优化是一个复杂的过程。除了大量的参数，每个因子也可 以对提取效率有显着影响。因此，建立的最佳设置既是一个非常重要的又有可能 是很费时的过程。几种统计技术，如因子设计与多直系回归，在优化分析方法已 经采用。因子设计有一定的优势，可以提供全局最佳条件，大量的定量信息可以 得到和可估计离散和连续的因素。已被用于因子设计，以确定影响上的过程中有 许多参数，包括温度，压力，前处理

5、的样品，提取时间，流体流速，加入改性剂5。几项研究已经表明，向日葵属（向日葵）含有具有生物活性性质的化学物质， ，10，11。这种植物的提取物可以作为一种天然的除草剂使用，以减少控 制作物对合成除草剂的依赖。向日葵是其生物活性方面的研究最广泛的植物之 一，第一参考关于它的化感效应于1931年发表。然而，在这些绝大多数情况下， 叶子的水提取物的生物活性被研究和非极性溶剂的萃取极少被研究6，12。在以往的工作中，我们开始着手解决向日葵的叶子中提取生物活性物质。前 处理样品和助溶剂的存在下，对所得到的提取物的产率和生物活性的影响进行了 以下研究。实验涉及低和高极端的温度和压力，即100和500bar

6、的压力下，35和50C 之间。然而，对于研究压力和温度的中间值也是重要的。基于以前的工作中得到 的有希望的结果，决定使用二氧化碳作为提取溶剂，12。前处理的向日葵叶提 取物在收率和生物活性方面是一个关键因素。当在极端的温度和压力值时进行提 取，结果发现，干燥的样品给出了最好的产率和凝结的样品的最佳生物活性数据。 因此，对前处理两种类型的压力和温度的影响进行更深入的研究。在异种抑制作用研究方面，对于异种抑制作用的植物物种的筛选和生物活性 粗提物，分离部分和纯化合物而言，生物分析是有用的工具。异种抑制作用的发 现策略涉及粗提物的筛选和纯化生物活性的化合物。最初的生物测定必须要快、 经济和系统问题与

7、相关的。一个为纯化合物的隔离生物活性导向的分馏过程之后 是通过生物测定；因此，全过程（提取，分离和纯化步骤）取决于生物测定结果。 在这个阶段，我们是在第一层次;研究高效提取新技术用于固体物提取，而不会 失去活性。下一个层次的研究将涉及化学结构特征，并发现最终生物活性化合物 和比较这些结构与先前使用常规提取方法分离化合物的生物活性的数据。这里进 行的工作涉及多项实验数据，为了分析对采用超临界二氧化碳时生物活性物质的 提取率的效果，进行一个多层次的阶乘设计的温度和操作压力，随后使用该程序 STATGRAPHICS大5.1 （统计Graphics公司）开发的经验公式来预测的提取过程 中得到的产率。2

8、材料与方法2.1样品和化学品叶向日葵属（品种艾塔娜）在2005年7月期间收集的第三家工厂的发展阶 段（植物1.2米高的花，收获前1个月）和植物提供：默塞德牧场，农业研究 站（CIFA），军政府的安达卢西亚，西班牙赫雷斯。将样品存储两组条件下，以评估每个提取物的提取率和生物活性方面的行 为：样品凝结在-25C。样品在室温下干燥（251C），直至达到恒重。其它化学所用的试剂的式样顷中给定的于表1。表1ReagentPurityCompanyCarburosUseExtraction atCarbon dioxide99.995%Metallichigh pressureWaterMilli QCo

9、solventMethanolPAPanreacCollection ofextracts andReagentPurityCompanyUsecosolventCitric acid monohydratePotassium phosphatePAPanreacPreparation of bufferDi-basic 3-hydratePAPanreacPreparation of bufferSucrosePAPanreacPreparation of bufferDissolution ofDimethyl sulfoxidePAPanreacthe extractsand cosol

10、vent2.2高压提取提取物在伊斯科进行了提取（内布拉斯加州，美国，220模型SFX）。该设备 包括一个提取器，一个SFX200控制器，限流器和一个注射器泵。在以前的出版 物12中可以找到的设备的进一步的细节的示意图。操作系统方法装载约2克样品萃取小柱，在所有的实验中先前已均匀化以保 持恒定的表观密度。卡盒然后引入到提取器中，并放置15分钟以达到工作温度。 该泵用二氧化碳加载，直到达到泵的工作压力。自动提取的减压阀被关闭，打开 泵连接的阀被和打开提取阀。然后用二氧化碳加压提取，允许经过一段时间的 15分钟静态萃取。微米阀已达到平衡状态时，打开微米阀恒温控制的节流阀（40C时），直 到一个恒定的

11、流量达到7.03mmol/min。然后进行5小时的提取。对每个样品的 实验进行了一式两份，以评估测量的变异性。将萃取液收集在含有甲醇的玻璃试管中，并储存在4T下的光照条件下，直 到随后的分析中排除。提取过程完成后，在40r的温度下用氮气流除去溶剂。中间的压力条件进行了测试，用的下限为100bar，因为它附近的二氧化碳 的临界压力（72bar）压力上限被所使用的设备（500bar）限制。可能的热降解 的物质在相对低的温度，35，40，45和50C进行实验。2.3实验设计a多层次的因子设计为了确定因素影响的过程和它们之间的关系，进行一个多层次的因子设计。 选择的变量进行实验设计如下：样品的前处理，

12、提取温度和提取压力物理值示于 表2在此设计基础上，一共有40个实验，在一个随机的方式进行，以减少错误。表2中实验设计的物理值LevelsFactor Experimental variableAPre-treatmentCongealed DryTTemperature (C)35 4045 50PPressure (bar)100 200 300 400 500对实验数据进行用于连同程序STATGRAPHICS+ 5.1 （1994-2001，统计 Graphics公司）开发的经验关系式，预测的提取中获得的产率。2.4生物测定胚芽鞘生物测定构成一个重要的工具，根据上一节中所描述的条件，来评估

13、所提取 的物质的生长抑制或刺激的活动。在黑暗中小麦（普通小麦品种杜罗）种子播种 在直径15厘米的培养皿蘸清水生长，221C下为3天。从芽的根和颖果被拆 除。后者被放置在一个铡和心尖部2毫米的部分被切断，并丢弃。在接下来的4 毫米长的胚芽鞘被拆除，并用于生物测定。所有的操作均根据绿色安全灯。化合 物溶解于DMSO中，并稀释到最终的生物测定浓度。平行控制，也可以运行7在2.2节中所描述的条件下称量得到的各提取物的样品（16mg）。用来测定 生物活性的提取物加入到试管中，并溶解在16毫升含有2%蔗糖的水溶液的磷 酸盐/柠檬酸盐缓冲液（pH5.6）中。因此，加入的提取物是不溶于水和DMSO， 以确保完

14、全溶解。对每个提取物用以类似的500，250和125 ppm方案方式制备。在22C下黑暗中，五胚芽鞘被放置在每个试管中的样品以每分钟6转的旋 转的辊管装置旋转24小时。胚芽鞘长度通过图像的数字化进行测量。数据从控 制的百分比差异表现出来。每次检测进行四次，并每隔一天检测。2.5集群分析使用SPSS10.0程序（社会科学统计软件包）进行统计处理。基于生物活性对每一个的不同组提取条件的数据进行关联分析。为了进一步 分析簇之间的关系，形成集群那些个体，树状图生成的聚类分析之间的归一化数 据的平方欧氏距离，用于测量样本之间的相似性。3实验结果十叶的萃取率示于图中。1在不同的压力，温度和样品的预处理条件

15、下，提 取时间为5小时。Sample congealed ai -25 父Sample driedJJdulus .MPbl- ME800- 图f购从实同的操作i 3结果示于表3。图用图形来表示方程。图2干样品在不X 500 barts p-valUe35 CPressure (P) 390.69 0.0000Temperature0.0010(T)47.29Pre-treatment(A)399.28 0.0000PP-6.38 0.5049PT212.95 0.0000PA184.08 0.0000TT12.990.5739TA8.420.5413.100在-300一和50唤的压力得到的提

16、取物的生物活性测定的结果示于图3中。数据表示为控制的百分比差异，一个零值代表一个相同值的控制。另方面，正值表示刺激参数和一个负值表示根据给定的实验条件下小麦胚芽鞘的生长抑制。Dendrogram4讨论结果4.1提取率根据我们的实验数据（图1）,从干燥的样品，得到最佳的萃取率。一旦叶 子已被切断，原料的存储是一个基本因素，关键是要知道他们经过处理如何影响 提取率和生物活性物质。此外，研究了提取过程同时显着影响的两个变量是选择 性的压力和温度。其中的水分凝结样品似乎是一个削弱了提取率的因素，水作为 溶剂与超临界CO竞争。如果过量的水保留在萃取容器中，高水溶性的溶质进行 分区到水相中，因此，超临界流

17、体萃取回收将是低的。从图1中可以看出，在一个恒定的温度，提高压力增加超临界流体的密度。 即，其溶剂化功率变大，更多的物质被转移到超临界CO，这意味着有利于提取 过程。出于这个原因，在升高的压力下进行提取看来有利的。温度上升，在恒定压力下（100至200bar），证明是不利的提取过程。例如， 在压力为100和200bar时，温度增加导致提取率的下降。这种现象被归因于在 超临界流体的密度减少，它的溶解力下降。在这些结果的基础上，50C和100bar 是不可取的，因为它的收益率是非常低的。然而，在较高压力下（400和500bar） 温度上升，有利于提取过程的物质的蒸汽压力的增加，由于提取的改变超过补

18、偿 在超临界CO的密度的减少。超临界流体萃取，在温度高于50C不进行，以便避 免热降解的化合物。这些结果与文献报道一致13，14。300bar时提取率与温度无关。超临界二氧化碳浓度的减少和化合物的蒸气 压的增加随着温度的升高之间有补偿。出于这个原因，在此压力下，研究系统的 行为是非常重要的。同时牢记上述结果，进行一般相关的生物测定，对在300bar得到的提取物， 和在500bar所获得的提取物给定的温度对提取率的影响非常小，因为这些提取 率最高。4.2实验设计分析实验设计的分析结果示于表3。给出估计影响和研究变量范围的相互作用和 提取过程的方差分析。每个相关联的符号的效果表示一个正或负的对产率

19、的影响, 各因素的重要性的程度由它的p值表示在表3中，当一个因素具有一个p-值小于 0.05，在0.95置信水平的显着影响的过程。所获得的结果表明、压力、温度、前处理和组合的相互作用压力/温度和压 力/前处理有显着的影响（95%置信水平），对过程的影响为正。使用的实验数据和程序STATGRAPHICS得到经验关联。这些相关性与变量 相关影响超临界临界二氧化碳的生物活性化合物的提取工艺。下面给出了得到的 表达（式（1）。（1）R=10.02 X 210- 1.91P- 27.96T- 37.73A- 2.04 X 10- 4P2+7.09 X 10- 2PT+ 0.46PA+0.11T2+0.5

20、6TA其中R是提取率毫克extract/100克十样品A的前处理， T为温度 C，P为压力bar。将所得的相关系数为0.97。（1）在图中以图形方式表示，在不同的操作条件下，干样品。图表的详细分 析表明，产量最高的是在50 C和500bar;其他方面，如生物活性和经济方面需 要考虑，对一个过程还必须考虑到选择合适的压力。4.3生物测定为了选择提供提取液最好的生物活性的条件，需要进行一般的生物测定。因 为，在一般情况下，提取物的生物活性越强，化感作用越大7。这项研究的目的 不是确定具体值，而是试图获得的活性曲线，基于提取物将会有更多的生物活性， 当随样品稀释其活性水平持续存在。关于对照活性的数据

21、，测定得到的提取物在 300和500bar的凝结和十的样品表示在图3中。实验的误差为5.9%左右。它也 可以从图3得到，选择在不同的压力下的得到的提取物的活性水平，有一个明显 的区别。在500bar十样品中得到的提取物在1000ppm表现出-100 %的活性和稀释250 ppm约有-50%的活性。获得的提取物与凝结的样品在500bar和50C下1000ppm 也表现出-100%的活性和稀释为125 ppm约-50%的活性。这些表现出最好的活 性数据的提取物的活性水平经稀释后没有明显下降。在500bar35C得到的提取物，凝结样品表现出出了不同类型的特性。在这些 情况下，活动水平经稀释后大大下降

22、。在300bar得到的提取物活性曲线也显示 稀释后活性水平显着降低。聚类分析中得到的结果表示在图4中。一般的生物活性分析的8个试验次序 而分组。不存在一个单一的标准来选择聚类数目，但大多数研究者同意当观察到 显着的距离变化时，过程应停止。树形图中bar变得越来越大15，在300bar提 取的样品和在35 C和500bar凝结提取样品形成了综合结果，它显示了活性随 稀释增加明显降低。5结论实验结果的基础上，所有这里使用超临界二氧化碳作为提取溶剂进程报告可 以得出结论，在500bar的压力下，以50C的温度下干燥样品，得到最佳的萃取 率。然而，对500bar和50C之间凝结萃取的样品，得到的最佳活

23、性的数据进行 了聚类分析，以评估结果细分成组是否是可能的。结果发现，两个实验在500bar 干燥的样品与在500bar和50 C下从萃取液中获得的凝结样品得到类似的结果。 干燥样品是可取的做法，基于萃取率是较高的，活性数据是可以接受的。在实地 叶子是干燥的，其结果是，这样一个过程从工业的角度来看是可行的。凝结样品 的实验室规模的研究，另一方面仍是有价值的，因为在50C, 500bar获得的提 取物着重指出更好的生物活性数据。这个方面对物质的提取鉴定具有特殊意义。参考文献B.E. Berg, H.S. Lund, A. Kringstad, A.L. Kvernheim.Routine anal

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