分子生物学基础

1、第二章动物生物技术的分子生物学基础一、遗传信息传递的方向中心法则逆转录病毒和逆转录酶美国病毒学家特明蛋白质的生物活性 氨基酸顺序 特定的三维结构的完整性遗传信息从基因转变成具有生物活性的功能蛋白质是通过两种“密码”介导：遗传密码，通过遗传密码将mRNA多核苷酸顺序译成线性多肽链；折叠密码（folding code）,其决定存在于氨基酸顺序中一维结构信息向蛋白质特定的三维结构的转变。RNA 多肽链 蛋白质二、DNA的复制 准确复制1、DNA复制从特定的位点开始 酵母的自主复制序列（ARS） A T T T A T Pu T T T A T A A A T A Py A A A T2、半保留复制3

2、、半不连续复制 4、DNA复制具有高度的忠实性 DNA聚合酶的自我校正功能 5、多种酶和蛋白因子协同作用DNA复制的特点：1，复制起点 复制或重新起始（ de novo initiation ）或复制叉式（ replication fork ） 双链环状DNA的复制眼可以形成一种结构，形状像希腊字母单向复制双向复制D 环复制 （Displacement form ） 又称置换式 线粒体和叶绿体DNA的复制方式 复制或滚环式复制（rolling circle replication）或共价延伸方式（covalence elongation） 由于复制时产生的滚环结构形状象，称复制 病毒、细菌因子

3、 ，如含有单链环状DNA的X174、G4、M13 线性DNA 双链的复制单一起点、单向，如：腺病毒单一起点、双向，如：T7噬菌体多个起点、双向2、半保留复制1958年，Meselson 和Stahl证明 DNA半保留复制。 半保留复制是遗传消息能准确传代的保证。是物质稳定性的分子基础。 StahlMeselson碱基的配对使得双螺旋DNA分子在复制时以半保留的形式进行。 3、冈崎片段与半不连续复制（okazaki 1968年）（OriC in E. coli chromosomal DNA)大肠杆菌的DNA复制 四个9bp的重复序列 dnaA结合位点 三个13bp的重复序列若干GATC位点 *

4、 转录激活 * DnaA 识别并结合复制起点，DnaBDnaC六聚 体与oriC 形成预引发体 * DnaG加入形成引发体（oriC引发体），合成引物RNA * 引物合成后，DNApol 组装到引发的RNA上，完成复制体的组装简单复制过程DnaASSB13bp repeats涉及转录激活一分子的 DNA pol III. 协同合成前导链和后随链复制终止a、终止序列 E.coli 有两个终止区域，分别结合专一性的终止蛋白 序列一：terE terD terA 序列二：terF terB terC 每个区域只对一个方向的复制叉起作用 b.专一性终止蛋白 E.coli 中由 tus gene 编码

5、通过抑制DNA螺旋酶而发挥终止作用ter4、DNA损伤与修复光复活切除修复重组修复SOS修复phR 471aa（一）photo reactivation（光复活）-TT-AA-TT-AA-TT-AA-TT-AA-可见光激活可见光（最有效波长400nm）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体是一种高度专一的修复形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚体（二）切除修复（excision repair）即在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤的部分切除掉，并以完整的那一段为模板，合成出切去的部分，从而使DNA恢复正常，这是一种比较普遍的修复机制细胞的修复功能对于保护遗

6、传物质DNA不受破坏有重要意义（三）重组修复（recombination repair）又称复制后修复（postreplication repair）受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子代DNA链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重复修复，并非完全校正（四）、SOS修复允许子链DNA复制合成时越过亲链上受损伤的片段而不形成缺口旁路系统是DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，又称倾错

7、性修复（Error-Prone Repair ）三、原核和真核生物基因结构的特征原核基因： 1、功能相关的基因大多是以操纵子结构出现； 2、蛋白质基因通常以单拷贝的形式存在； 3、编码RNA的基因通常是多拷贝的； 4、位于DNA上的各种调控元件的DNA顺序是多种多样的，为基因表达调控的多样性和精确性提供了结构基础。真核基因：1、复杂的染色体结构：着丝点、端粒，与DNA复制起点一起构成染色体不可缺少的三要素2、DNA重复顺序重复序列的存在是真核生物DNA区别于原核生物DNA的一个重要特征3、基因的不连续性（外显子、内含子）、真核生物基因组中有许多来源相同、结构相似、功能相关的基因组成为单一的基因

8、簇或基因家族（gene Family） Alu序列家族5、存在串联重复基因四、RNA的转录和RNA的加工发生在细胞核中，以DNA分子为模板，按照碱基互补的原则，合成一条单链的RNA即mRNA，DNA分子携带的遗传信息被转移到RNA分子中。其过程与DNA的复制基本相同1、RNA转录转录的起始转录的延伸转录的终止 RNA聚合酶（RNA-pol） 1、不需要引物，能发动新链，也能延长多核苷酸链 2、合成方向53，按碱基配对原则（A-U,C-G） 3、要求有完整的DNA双链或单链为模板 4、需要4种三磷酸核苷酸-ATP,GTP,UTP及CTP为反应底物 5、能识别DNA链上起始点特点： 转录的起始大肠

9、杆菌RNA聚合酶-a2bbs a 2bb + s = a2bbs 核心酶 + s = 全酶分子量功能a36 512决定转录的基因b150 618催化转录 b155 613结合DNA模板(开链)s 70 263辨认起始点真核生物的RNA聚合酶RNA聚合酶别名rRNA聚合酶不均一RNA聚合酶小分子RNA聚合酶定位核仁核质核质转录产物tRNAmRNAtRNA.5srRNA-鹅膏蕈碱的影响不敏感高度敏感中度敏感 因子辨认起始点RNA聚合酶全酶结合到起始点 打开双链RNA链合成开始 因子脱落，RNA链延长转录的起始1）、与转录调控有关的DNA序列10区pribnow框（TATAAT）：RNA聚合酶的牢固

10、结合位点35区Sextama框（TTGACA）：RNA聚合酶的识别位点一般来说，对于给定的启动子，其特异性序列趋于启动子共有序列时10与35区之间的间距趋于17bp时，启动子的转录效率可能就高天然启动子中这段距离多为1520bp编码链AACTGTATATTA模板链TTGACATATAAT35DNA转录起始点Pribnow盒子启动子35 10 +1转录区53RNA转录起点与新生RNA链第一个核甘酸相对应DNA链上的碱基 原核生物启动子结构典型启动子的结构 -35-10转录起点16-19bpTTGACATATAAT5-9bp真核生物的启动子：帽子位点及转录的起始位点，其碱基大多是ATATA框：处转

11、录起始点上游30区到25区段 ，框内任何碱基的替代突变都使转录活性降低，是绝大多数真核基因正确表达所必需的 在起始位点的上游50、75、100左右都存在与基因转录起始有关的序列：75区附近的CAAT框可能控制着转录起始的频率增强子 负控制序列真核生物启动子的结构核心启动子（core promoter）上游启动子元件（upstream promoter element，UPE）上游启动子元件包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等作用：控制转录起始频率CAAT：-70 - -80bpGGGCGG：-80 - -110bp转录的延伸在转录泡上进行53DNA原核生物转录过程中的羽毛状现

12、象核糖体RNARNA聚合酶出现延宕 减少DNA序列中的GC碱基对的含量 RNA聚合酶没有校对能力，转录过程没有校对机制 转录的精确性必须依靠RNA聚合酶在选取互补核苷酸或拒绝非互补核苷酸的立体化学特性真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。 转录的终止 RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来，就是转录终止。强终止子内部终止子弱终止子 需要因子（rho factor） 又称为依赖性终止子 （Rho-dependent terminator）不依赖Rho ()因子的转录终止依赖Rho ()因子的转录终止A T P

13、A. 依赖 Rho因子的转录终止因子：六聚体蛋白、水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录RNA 聚合酶因子附在RNA链上因子RNA 链形成一个发夹结构，转录停止，因子利用ATP能滑行因子发挥解螺旋酶活性，解开发夹和RNA-DNA依赖Rho因子的转录终止B. 非依赖 Rho因子的转录终止DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来 终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，长度 效率 茎环结构使转录终止的机理 使RNA聚合酶变构，转录停顿 使转录复合物趋

14、于解离，RNA产物释放5pppG5 335RNA-pol原核生物和真核生物初级转录产物都需经一定程度的加工才具有活性。原核生物RNA加工、真核生物RNA加工2、RNA加工原核生物中rRNA前体的加工甲基化作用专一核酸外切酶30S前体17StRNA25S专一核酸外切酶16S rRNAtRNA23S rRNA5S rRNA专一核酸外切酶tRNA前体分子的加工a、切除tRNA前体两端多余的序列： 5端切除几到10个核苷酸。b、末端添加：3-端添加CCA序列。c、修饰：形成稀有碱基如DH2 。RNAasePRNAaseFRNAasePRNAaseFRNAaseDRNAaseDACC表示核酸内切酶的作用

15、 表示核苷酸转移酶的作用 表示核酸外切酶的作用 表示异构化酶的作用 帽子结构：7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp）5 pppGp5 GpppGppppG ppi鸟苷酸转移酶5 m7GpppGp甲基转移酶SAM帽子结构的生成5 ppGp磷酸酶 Pim7Gppp鸟甘酸转移酶帽子结构功能： 能被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合； m7Gppp结构能有效地封闭mRNA 5末端，以保护mRNA免受5核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。 特异 内切酶识别AAUAAA及随后的GUGUGUG并在其间酶切，在3端聚合50-200poly(A)I 协助成熟的mRNA从细胞核向细胞质转运；ii.提高m

16、RNA在细胞质中的稳定性；iii.作为核糖体的识别信号，使mRNA得以有效翻译； 加 尾3、RNA剪接剪接：剪接体与处于内含子5端的5剪接位点和3端的3剪接位点相互作用而完成。剪接体：一类复杂的核糖核蛋白颗粒，由核小RNA（small nuclear RNAs,snRNA）和各种蛋白质组成。snRNA :分子内富含尿嘧啶核苷酸，称为U1、U2、U4、U5、U6。snRNP: snRNA与特定的蛋白质结合，组成特定的核小RNA蛋白体。完整的剪接体就是通过U snRNP之间RNA同蛋白质、RNA同RNA以及蛋白质与蛋白质相互作用组装而成。外显子内含子DNAmRNA转录形成套索RNA，外显子靠近剪接

17、体去除套索RNA，外显子连接成熟mRNAmRNA的剪接靠近 连接4、RNA的编辑编辑（editing）是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。C变为U碱基的突变尿苷酸的缺失和添加1986.R.Benne在研究锥虫线粒体mRNA转录加工时发现mRNA的多个编码位置上加入或丢失尿苷酸，1990年在高等动物和病毒中也发现了编辑现象。 锥虫coxII 基因的编辑原核生物与真核生物mRNA的特征比较1、原核生物mRNA的特征 半衰期短 多以多顺反子的形式存在 多顺反子mRNA：编码多个蛋白质的mRNA。单顺反子mRNA：只编码一个蛋白质的mRNA。 5 端无“帽子”结构， 3 端没有

18、或只有较短的poly（A ）结构。SD序列：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。 2、真核生物mRNA的特征 5 端存在“帽子”结构多数mRNA 3 端具有poly（A ）尾巴（组蛋白除外）以单顺反子的形式存在“基因”的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核甘酸序列。原核生物和真核生物mRNA结构的比较五、翻译蛋白质的生物合成1、遗传密码：UAA、UGA、UAG 61个密码子特点：通用性；兼并性； 摇摆假说遗传密码使用的偏倚性：蛋白质生物合成时对兼并密码子使用的频率不同，对于一个给定的氨基酸而言，有的密码子使用频率明显高于其它密码子。在基因的化学合成过程中，可通过选择性的

19、使用“高频”密码，改善基因在宿主细胞中的表达水平。 密码子的不重叠性和阅读方向。酵母、无脊椎动物、脊椎动物的线粒体以及在支原体中的遗传密码出现了一些偏离。UGA色氨酸 AGA、AGG（精氨酸）终止密码 AUA（异亮氨酸）甲硫氨酸CUA（亮氨酸）苏氨酸 AGA（精氨酸）丝氨酸2、蛋白质生物合成的过程蛋白质的生物合成过程是由肽链的氨基端到羧基端依次加氨基酸的肽链成长过程，每次在已有肽链的羧基端加上一个氨基酸。以mRNA为模板，氨基酸经活化获得的氨酰tRNA为原料，GTP、ATP供能，在核糖体中完成。蛋白质的合成过程翻译过程中，由于每一个氨基酸是严格按照mRNA模板的密码序列被逐个合成到肽链上，因此

20、，mRNA上的遗传信息被准确地翻译成特定的氨基酸序列。细胞质中，翻译是一个快速过程，一段mRNA可以相继与多个核糖体相结合，同时连续进行多条同一种新肽链的合成。遗传信息流由DNARNA蛋白质流动。RNA的自我复制，反转录保证蛋白质合成正确性的机制：很多氨基酰tRNA合成酶有两个活性位点： 一个负责氨基酰tRNA的形成 另一个位点负责识别连接在tRNA上的氨基酸是否正确。 如果发现连接在tRNA上的氨基酸不正确，则其通过水解去除错连的氨基酸，从而防止了氨基酸的错误掺入。动力学校对机制：氨基酰tRNA上的反密码子与mRNA上的密码子的结合和肽链形成不是同时进行，而是有一个时间差。只有那些具有正确反

21、密码子的tRNA才能同它们在mRNA上相应的密码子之间保持足够长的时间，使新的肽链得以形成。如果进入的tRNA不正确，由于上述的时间差，在肽链没有形成之前，错配的tRNA就从核糖体复合物上除去，从而减少了不正确氨基酸错误掺入到新生肽链中去的几率。3、蛋白翻译后的修饰和加工及折叠N端的Met和fMet的去除去除功能蛋白质不再需要的肽段对多肽链氨基酸侧链的各种修饰：磷酰化、甲基化、羟基化、乙酰化、糖基化等硫硫键的形成分子伴侣新生蛋白质经蛋白酶切后变成有功能的成熟蛋白质前胰岛素原蛋白翻译后成熟过程示意图5、蛋白质的剪接1994年Perler等人对与蛋白质剪接有关的成分进行了规范化的定义和命名：将按正

22、确阅读框插入到前体蛋白质序列中，并在蛋白剪接或成熟过程中切出的蛋白序列称为蛋白内含子（intein）,而处于intein旁侧，相互首尾相连以形成成熟蛋白产物的蛋白质序列，称为蛋白外显子（extein）.蛋白质剪接是在前体蛋白水平上，而不是在RNA水平上进行。蛋白质剪接是从前体蛋白内切除inteins,并将exteins以肽链相连，产生成熟的蛋白质的过程，切除inteins,连接exteins二者缺一不可。蛋白质剪接的结果是由一个单一的前体蛋白产生两个或多个蛋白质。六、基因的表达调控1、原核基因表达调控 操纵子：乳糖操纵子、色氨酸操纵子2、真核基因的表达调控（1）、转录水平的调控（2）、转录后调

23、控（3）、翻译水平的调控（4）、无功能DNA与真核基因表达调控一、原核基因的表达调控降解物基因活化蛋白(CAP)特异的结合在启动基因上时，能促进RNA聚合酶与启动基因结合，并促进其进行转录；游离CAP不能与启动基因结合，必须当细胞内有足够的cAMP时，CAP首先与cAMP形成复合体，才能与启动基因结合，而葡萄糖的降解产物能降低cAMP的含量2、trp 操纵子的阻遏系统低Trp时：阻遏物不结合操纵基因;高Trp时：阻遏物+Trp 结合操纵基因衰减子：在转录水平上调节基因表达的衰减作用，用于终止和减弱转录，这种调节的作用部位叫衰减子是一种位于结构基因上游前导区的终止子。UUUUUUUU调节区 结构

24、基因 trpROP前导序列 衰减子区域 UUUU前导mRNA1234衰减子结构 第10、11密码子为trp密码子 终止密码子 14aa前导肽编码区: 包含序列1 形成发夹结构能力强弱： 序列1/2序列2/3序列3/4 trp 密码子 UUUUUUUU34UUUU 334核糖体 前导肽 前导mRNA1.当色氨酸浓度高时 转录衰减机制 125 trp 密码子 衰减子结构就是终止子可使转录前导DNA UUUU 3 RNA聚合酶 终止UUUU342423UUUU核糖体 前导肽 前导mRNA 15 trp 密码子 结构基因前导DNA RNA聚合酶 2.当色氨酸浓度低时 Trp合成酶系相关结构基因被转录

25、序列3、4不能形成衰减子结构 细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停下来。阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少；弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA的多少。它通过前导肽的翻译来控制转录的进行，在细菌细胞内这两种作用相辅相成，体现着生物体内周密的调控作用。原核生物操纵子，真核生物？2、真核生物基因的表达和调控真核生物基因表达与调控的复杂性：（1）真核生物具有由核膜包被的细胞核，其基因的转录发生在细胞核中，而翻译则发生在细胞质中（2）真核生物基因数目比原核生物多，大多数基因除了有不起表达作用的内含子，另外还有更多调节基

26、因表达的非编码序列，真核生物所转录的前体mRNA必须经过加工成熟后才进入表达阶段。真核生物基因表达与调控的复杂性真核生物基因表达与调控的复杂性：(3) 真核生物染色质由DNA与5种组蛋白结合组成，它们折叠和缠绕形成核小体，核小体及染色质进一步折叠缠绕形成超级结构状态的细胞分裂中期染色体。染色质的结构对基因的表达起总体控制作用。（4） 化学信号包括某些激素的诱导控制作用。（5）基因组内DNA的化学修饰（6）发育过程中高度分化的机制真核生物基因表达的调控可发生在不同水平上（1）、转录水平的调控 调控区（顺式作用因子）：转录起始位点上游的GC盒（GGGCGGG）、CAAT盒（GGCCAATCT）、o

27、ctamer(八聚体基序)以及增强子序列。 蛋白因子（反式作用因子）：通用（或基础）转录因子、启动子特异转录激活蛋白 、辅助激活蛋白因子。 （2）转录后调控转录衰减：RNA分子转录提前终止 RNA的可变剪接 ：由于存在“内含子序列的不确定性或多义性”RNA的编辑 ：校正基因的移码突变；可以在mRNA上重新构建或去除起始密码区，控制蛋白质合成；可以在基因原来的起始密码前构建新的AUG起始密码，扩充遗传信息。（3）、翻译水平的调控：i、原核和真核细胞利用不同的策略去确定在mRNA分子上的翻译起始位点：原核：SD序列真核：由AUG密码子同mRNA分子的5端帽子结构的接近程度而决定的 ii、5非翻译区

28、二级结构对翻译起始既可表现出负控制又可表现出正控制效应：当5UTR的序列中存在着碱基配对时，就可形成发夹式或茎环二级结构，这种结构阻止核糖体小亚基的迁移，对翻译起始具有顺式阻抑作用 。作用的强弱取决于发夹结构的稳定性及其在5UTR的位置 碱基配对区越长或G+C含量愈高，发夹结构就愈稳定；当发夹结构位于AUG下游14个核苷酸距离时，增强了原来的起始效率 iii、起始密码子（AUG）先导序列的长度影响翻译起始效率：先导序列长度：mRNA分子中第一AUG到其帽子间的距离。 长度12个核苷酸时，即使AUG置于理想旁侧序列中，仍一半以上的核糖体40S亚基滑过第一个AUG，从其下游的AUG启始翻译；长度20核苷酸，可以防止滑过现象；长度在1718个核苷酸之间，其翻译效率与其长度成正比；加长先导序列的长度还可以减弱AUG5端的二级结