酶和细胞固定化技术

1、第一张，PPT共七十页，创作于2022年6月第一节 酶的固定化水不溶性载体水溶性酶水不溶性酶（固定化酶）固定化技术第二张，PPT共七十页，创作于2022年6月固定化酶是指借助于物理或化学方法，将酶固定在载体上，并在一定的空间内进行催化反应的酶。固定在载体上的菌体或菌体碎片称为固定化菌体。第三张，PPT共七十页，创作于2022年6月固定化酶的特点稳定性提高，使用寿命延长可得到高纯度、高产量的产品可以连续化生产操作反应的最优化控制成为可能再生产利用第四张，PPT共七十页，创作于2022年6月缺点酶活力有一定损失，初始的投资大。只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜。与完整细

2、胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后，才能固定。第五张，PPT共七十页，创作于2022年6月一、酶的固定化方法1物理吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。载体类别： 天然无机载体 ：活性炭，硅藻土，硅胶等。 有机载体：淀粉，纤维素，谷胶原等。 第六张，PPT共七十页，创作于2022年6月第七张，PPT共七十页，创作于2022年6月第八张，PPT共七十页，创作于2022年6月第九张，PPT共七十页，创作于2022年6月2、包埋法 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。分为：（1）网格型（2）微囊型第十张，PPT共七十页

3、，创作于2022年6月（1）网格型 将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。第十一张，PPT共七十页，创作于2022年6月载体材料：合成高分子化合物：聚丙烯酰胺，聚乙烯醇，光敏树脂天然高分子多糖类：淀粉，明胶，海藻酸，角叉菜胶。第十二张，PPT共七十页，创作于2022年6月 聚丙烯酰胺包埋制备固定化酶的过程：将酶溶液加入到含有丙烯酰胺（单体）和N，N-亚甲基双丙烯酰胺（交联剂）的溶液中，再加入二甲氨基丙腈（加速剂），同时加入过硫酸钾（引发剂）混合，于25保温10min，即得含酶凝胶，将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒，于低温储存或冷冻干燥。第十三张，PPT

4、共七十页，创作于2022年6月（2）微囊型 将酶或微生物菌体包埋在高分子半透膜中的微囊内称为微囊型包埋法。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。第十四张，PPT共七十页，创作于2022年6月 界面沉淀法 利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜从而将酶包埋。 界面聚合法 利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合形成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊中。第十五张，PPT共七十页，创作于2022年6月 二级乳化法 酶溶液先在高聚物（乙基纤维素、聚苯乙烯等）有机相中乳化分散，乳化液再在水相中分散形成次级乳化液，当有机高聚物固定化后，每个固体球内包含多滴酶液。

5、 脂质体包埋法 采用双层脂质体形成的极细球粒包埋酶。第十六张，PPT共七十页，创作于2022年6月3、结合法 通过选择适宜的载体，通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。离子键结合法共价键结合法第十七张，PPT共七十页，创作于2022年6月离子键结合法通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。常用载体:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶使用注意：pH、离子强度、温度优缺点： 操作简便，条件温和，酶活力回收率高；易受缓冲液种类和pH影响，易脱离。第十八张，PPT共七十页，创作于2022年6月共价键结合法通过共价键将酶蛋白的侧链基团与载体的官能团结合的固定化方法。可以形成共价键的

6、基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键 (非活性中心基团)常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体优缺点：操作复杂，酶结构性质变化，回收率低，不适用于微生物细胞固定；不易脱落。第十九张，PPT共七十页，创作于2022年6月首先载体上引进活泼基团 关键 然后活化该活泼基团 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键共价键结合法制备固定化酶的“通式”第二十张，PPT共七十页，创作于2022年6月重氮法叠氮法烷基化反应法硅烷化法溴化氰法载体活化的方法第二十一张，PPT共七十页，创作于2022年6月 重氮法 是将带芳香族氨基的载体，先用Na

7、NO2和稀盐酸酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH89)条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。反应示意式如下 第二十二张，PPT共七十页，创作于2022年6月目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等该方法需要载体具有芳香族氨基第二十三张，PPT共七十页，创作于2022年6月 叠氮法 对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后与酶偶联。第二十四张，PPT共七十页，创作于2022年6月溴化氰法 主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔

8、网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。第二十五张，PPT共七十页，创作于2022年6月 烷基化反应法 含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。第二十六张，PPT共七十页，创作于2022年6月4、交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。第二十七张，PPT共七十页，创作于2022年6月酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到

9、水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶第二十八张，PPT共七十页，创作于2022年6月交联法常用试剂 常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱(shiff)。双重固定法吸附交联法 交联包埋法第二十九张，PPT共七十页，创作于2022年6月将酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，热处理也可与交联法或其他固定化法联合使用，进行双重固定化。5、热处理法第三十张，PPT共七十页，创作于2022年6月各种固定方法的特点比较第三十一张，PP

10、T共七十页，创作于2022年6月复合载体PEI-SIO2的制备首先对硅胶进行活化处理：取5g硅胶至于30ml甲烷磺酸水溶液控制温度在102，搅拌活化4h，洗涤，抽滤后真空干燥24h即可；然后使硅胶发生氯丙基化，将活化后的硅胶以二甲苯为溶剂，加入少量的水，与-氯丙基三甲氧基硅烷在80反应6h，抽滤后的产物在索氏抽屉器中用甲苯抽屉24h，以除去-氯丙基三甲氧基硅烷，分离后产物经真空干燥，所制产物为氯丙基化的硅胶（CP-SIO2）；第三十二张，PPT共七十页，创作于2022年6月最后，准确称量1g氯丙基化的硅胶，至于一定浓度的聚乙烯亚胺水溶液中，于一定的温度下反应一段时间，用大量蒸馏水冲洗产物，抽滤

11、，真空干燥后制得PEI-SIO2复合载体。第三十三张，PPT共七十页，创作于2022年6月第三十四张，PPT共七十页，创作于2022年6月第三十五张，PPT共七十页，创作于2022年6月 称取0.5g经干燥的复合载体PEI-SIO2，加入适量的戊二醛溶液，搅拌并在室温条件下反应1h，产物用蒸馏水冲洗后抽滤，再加入30ml经磷酸盐缓冲溶液稀释过的脂肪酶液，在恒温水浴振荡器中于给出的温度下震荡一定的时间，即可制的固定化的脂肪酶。 第三十六张，PPT共七十页，创作于2022年6月 Table 1 Independent variables and their levels for central c

12、omposite designIndependent variablescodesVariable levels-10+1Methanol molar ratioX1246Enzyme amount (%)X2369Hexane weight ratioX30.30.60.9Temperature()X4304050第三十七张，PPT共七十页，创作于2022年6月Independent variablescodesVariable levels-2-10+1+2Enzyme amount (%)X112345Added water (v/v)X2246810Methanol molar rat

13、io X323456Reaction temperature ()X42535455565Reaction time (h)X548121620第三十八张，PPT共七十页，创作于2022年6月RunX1X2X3X4True model (%)RSM model (%)Error (%)1-1-10047.446.661.562-110055.7453.843.4131-10045.6847.303.554110060.8661.320.75500-1-171.9371.350.81600-1167.9367.980.077001-170.8670.470.068001172.1772.410.

14、339-100-153.7455.583.4210-100154.3754.340.0611100-157.5859.112.6612100159.2758.910.61130-1-1066.0965.950.21140-11054.155.151.941501-1063.4563.980.7416011076.6178.322.2317-10-1046.3445.12.6818-101053.3750.714.981910-1056.4552.996.1320101055.850.938.73210-10-171.4468.683.86220-10170.1566.535.1623010-1

15、80.477.843.1824010182.0378.574.2225000089.3589.210.1526000089.6589.210.4927000091.0289.211.99第三十九张，PPT共七十页，创作于2022年6月 Y=-174.942+ 53.543X1+ 9.479X2+ 127.56X3+ 4.143X4+ 0.285X1X2- 3.198X1X3+ 0.013X1X4+ 6.986X2X3+ 0.024X2X4+ 0.442X3X4- 6.605X12- 1.167X22- 142.839X32- 0.058X42 第四十张，PPT共七十页，创作于2022年6月第四

16、十一张，PPT共七十页，创作于2022年6月第四十二张，PPT共七十页，创作于2022年6月Fatty acid methyl ester contetnt (%)Rention time (min)Content (%)7-Hexadecanoic acid mehtyl ester (C17H32O2)6.590.72Hexadecanoic acid mehtyl ester (C17H34O2)6.7314.829,12- Octadecadienoic acid methyl ester (C19H34O2)8.1835.799- Octadecadienoic acid methy

17、l ester (C19H36O2)8.2440.96Octadecadienoic acid methyl ester (C19H38O2)8.457.511-Eicosenoic acid methyl ester (C21H40O2)10.260.07Eicosenoic acid methyl ester (C21H42O2)10.530.14第四十三张，PPT共七十页，创作于2022年6月二、固定化酶的性质1、固定化对酶稳定性的影响 大多数情况下，具有较长的操作寿命和保存寿命。原因：酶固定化使其活性构象的牢固性增加，酶分子与载体的多方位连接降低了酶分子的伸展变性。酶固定化能降低自身降

18、解的程度载体的保护使得酶抗不良环境因素的影响的能力增强。第四十四张，PPT共七十页，创作于2022年6月固定化酶稳定性升高表现在：热稳定性增强对变性剂、抑制剂的耐受性提高对蛋白酶抵抗能力增加、储存稳定性和操作稳定性有所增强。第四十五张，PPT共七十页，创作于2022年6月2、最适温度 固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，但有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有明显的变化。第四十六张，PPT共七十页，创作于2022年6月1） 载体带负电荷，pH向碱性方向移动。 微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。最适pH值第四十七张，PPT共七十页，创作于2022年6月载体带正电

19、荷，pH向酸性方向移动。（2）产物性质对体系pH的影响 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高；反之则低。第四十八张，PPT共七十页，创作于2022年6月4、底物特异性 与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。5、米氏常数 固定化酶的表观米氏常数随载体的带电性能而变化。（1） 载体与底物带相同电荷，KmKm固定化酶降低了酶的亲和力。（2） 载体与底物电荷相反，静电作用，KmKm第四十九张，PPT共七十页，创作于2022年6月三、固定化酶的应用1、工业生产中的应用（1）氨基酰化酶（2）葡萄糖异构酶（3）延胡索酸酶第五十张，PPT共七十页，创作于2022年

20、6月2、酶电极（1）葡萄糖电极半透膜酶胶层感应电极酶电极示意图第五十一张，PPT共七十页，创作于2022年6月葡萄糖醌H2O葡萄糖酸氢醌葡萄糖氧化酶氢醌 醌2H2ePt铂电极第五十二张，PPT共七十页，创作于2022年6月第二节 细胞及细胞器的固定化细胞固定化：通过各种方法将细胞与水不溶性的载体结合，制备固定化细胞的过程。固定化活细胞或固定化增值细胞：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。第五十三张，PPT共七十页，创作于2022年6月一、微生物细胞固定化固定微生物细胞时，操作简便易行，对细胞的生长、繁殖和新陈代谢没有明显的影响，但吸附力较弱，吸附不牢固，细胞容易脱落。 吸附法是

21、制备固定化动物细胞的主要方法，主要是因为动物细胞大多数具有附着特性。 吸附法是制备固定化植物细胞：硅藻土、多空玻璃、多孔陶瓷、多孔塑料、纤维素等。第五十四张，PPT共七十页，创作于2022年6月（2）包埋法 将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法（凝胶包埋法、半透膜包埋法）。琼脂糖凝胶包埋法海藻酸钙凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法第五十五张，PPT共七十页，创作于2022年6月2、固定化微生物细胞的特点固定化微生物细胞保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好。固定化微生物细胞保持了原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系，可以按照原来的代谢途径进行新陈代谢。发酵稳定性好，可以反复使用或连续使用

22、提高了细胞密度，提高产率。第五十六张，PPT共七十页，创作于2022年6月3、固定化微生物细胞的应用发酵生产各种胞外产物。利用固定化微生物细胞与各种电极结合制成微生物电极。呼吸活性测定型传感器：利用固定在高分子膜上的微生物细胞的呼吸作用，测定氧气的消耗和二氧化碳的生成，从而确定被测定物质的量。电极活性测定型传感器：利用固定在膜上的微生物细胞的新陈代谢作用，测定电极活性物质的量的变化，从而确定样品中欲测物质的含量。第五十七张，PPT共七十页，创作于2022年6月二、植物细胞固定化（1）植物细胞固定化方法吸附法：一般将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内，或者将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。包埋

23、法：将植物细胞包埋在琼脂、角叉菜胶、海藻酸钙凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、明胶等多孔凝胶中。第五十八张，PPT共七十页，创作于2022年6月（2）固定化细胞的特点固定化植物细胞发酵可以简便地在不同的培养阶段更换不同的培养液，有利于生产各种所需的次级代谢物。提高植物细胞的存活率和稳定,可连续使用较长的时间，大大缩短生产周期，提高产率.不容易聚集成团,有利于产品的分离纯化，提高产品的质量。第五十九张，PPT共七十页，创作于2022年6月（3）固定化植物细胞的应用 制造人工种子 细胞全能理论：在一定的条件下，细胞会生长、繁殖长成一颗完整的植株。 通过植物细胞培养技术，可以由一粒种子快速繁殖得到大量细胞，再通

24、过固定化技术进行人工种子的研制，获得大量具有相同遗传特性的植株。 固定化植物细胞可以用于生产各种色素、香精、药物、酶等次级代谢物。（胞外产物）第六十张，PPT共七十页，创作于2022年6月三、动物细胞固定化1、动物细胞固定化的方法 吸附法常用的吸附固定化载体转瓶：由玻璃或塑料制成，其表面经过一定的方法处理可带上电荷。微载体：颗粒细小的固定化载体，由带有表面电荷的葡聚糖、明胶、纤维素、聚丙酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。中空纤维：由聚丙烯、硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成，纤维管壁是半透膜。第六十一张，PPT共七十页，创作于2022年6月包埋法包埋法一般适用于悬浮细胞 凝胶包埋法：利用多孔凝胶为载体将动物细胞包埋固定化。琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白等