凋亡研究进展及凋亡检测

1、细胞凋亡研究新进展及凋亡检测技术 赵万洲 博士南京凯基生物科技发展有限公司2009.4.211完整版课件pptApoptosis - (Gr. falling) a process seen in multicellular organisms, by which specific cells are killed and removed for the benefit of the organism.Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H. and Currie, A.R. 1972. Br. J. Cancer 26:239.2完整版课件ppt细胞凋亡（apoptosis）概念

2、：程序化细胞死亡（Programmed cell death，PCD）是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。 3完整版课件ppta、凋亡概念的形成和形态学的研究(1972） 1965年发育生物学家Lockshin在研究硪发育过程中首次提出程序化死亡（programmed cell death ）概念。 1971年 澳大利亚生物学家Kerr用皱缩死亡来区别经典的细胞坏死。 1972年Kerr等在英国癌症杂志发表论文，首次提出细胞凋亡(apotosis)的概念。宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始。b、DNA的降解和内源性核酸内切酶的参与。(1987）c、蛋白质水

3、解酶活化的研究(1995)d、细胞膜的变化(1997)e、线粒体的变化和分子生物学的研究(1998-) 1) 相关基因及调控 2）信号转导 3）各种分子及其相互作用及相互关系 4）疾病机制的阐明，以及新疗法的探索及问世。凋亡的研究历史Science. 2005 Oct 7;310(5745):66-7. 4完整版课件ppt 细胞凋亡的研究意义在胚胎发育过程中：通过凋亡可清除对机体无用的、多余的、发育不正常的、以及有害的细胞。在成年机体中：通过凋亡消除衰老的细胞并代之以新生的细胞；清除体内受损伤的或有癌前病变的细胞，防止癌变；凋亡还参与构成机体的防御机制。5完整版课件ppt细胞凋亡异常是某些疾病

4、发病的重要原因：如凋亡不足引发恶性肿瘤、病毒性疾病和自身免疫疾病；而凋亡过量则可能产生艾滋病、重症肝炎与老年性痴呆症、帕金森氏症等，因此研究细胞凋亡已成为生命科学、医学病理学、药理学等学科的热点领域。 细胞凋亡的研究加深人们对生命现象及某些疾病的认识。6完整版课件ppt7完整版课件ppt坏死凋亡形态学特征膜完整性丧失胞浆和线粒体膨胀 全细胞裂解 胞膜出芽，但保持完整染色体聚集在核膜周边胞浆收缩、细胞核凝集最后细胞分裂为凋亡小体Bcl-2家族蛋白导致线粒体膜通透性增加生化特征离子内环境失调非能量依赖性的（被动过程，在4C也可以发生）随机消化DNA（电泳显示为DNA弥散状态）Postlytic D

5、NA断裂 ATP依赖性的（主动过程，在4C不能发生）以核小体为单位剪切DNA（电泳显示为DNA ladder）Prelytic DNA 断裂线粒体释放多种因子至胞浆中（细胞色素c、AIF）Caspases级联活化膜对称性改变（PS外翻）生理学特征影响群组细胞 由非生理学因素引起（如补体攻击、代谢中毒、缺氧等）被巨噬细胞吞噬 周围有明显的炎症反应只影响单个细胞 由生理学刺激诱导（如生长因子缺乏、激素环境改变等）被临近细胞和巨噬细胞吞噬 无炎症反应8完整版课件pptNormalApoptosisNecrosis9完整版课件ppt细胞凋亡的信号转导通路死亡受体信号通路线粒体信号通路内质网和高尔基体的

6、信号通路细胞凋亡的基因调控10完整版课件pptApoptosis-Death Receptor Signaling11完整版课件pptTNF receptor superfamily12完整版课件pptApoptosisCell deathFasFasLTNF-R1TNFTRADDFADDCas8CaseffMitCyt cProtein degradationDNase13完整版课件ppt14完整版课件ppt 1993年，研究发现秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans） Ced-3基因与哺乳动物细胞白细胞介素-1b 转化酶(interleukin-1b-convertin

7、g enzyme,ICE)存在功能和序列相似性。 ICE的高表达可导致啮齿动物成纤维细胞凋亡。1996年10月，推荐将ICE/Ced-3家族成员统一命名为Caspase（Cysteinyl Aspartate-specific Proteinases），按发现先后为序对其家族成员以阿拉伯数字排序（1-14）。15完整版课件pptCaspase家族成员特性一览表名称原名功能底物特异性Caspase-1ICE辅助促炎症YVADCaspase-2ICH-1凋亡反应VDVADCaspase-3CPP32,Yama,apopain凋亡反应DEXDCaspase-4ICErel-II,TX,ICH-2辅助

8、促炎症LEVDCaspase-5ICErel-III,TY辅助促炎症WEHDCaspase-6Mch-3凋亡反应VEIDCaspase-7Mch3,ICE-LAP3,CMH-1凋亡反应Caspase-8MACH,FLICE,Mch5凋亡反应IETDCaspase-9ICE-LAP6,Mch6凋亡反应LEHDCaspase-10Mch4凋亡反应AEVDCaspase-11ICH-3Caspase-12Caspase-13ERICELEEDCaspase-14MICE(Mini-ICE)注：W为色氨酸，E谷氨酸、H为组氨酸、D为天冬氨酸、I为异亮氨酸、L为亮氨酸、V为缬氨酸、X为任何氨基酸（by

9、Thonberry, 1997)16完整版课件pptCaspase活化的三种方式17完整版课件pptCaspase的活化18完整版课件ppt破坏细胞抗凋亡因素 正常活细胞因核酸酶处于无活性状态，这是由于核酸酶和抑制物结合在一起，如抑制物被破坏，核酸酶即可激活，引起DNA片段化。现知caspase可以裂解这种抑制物而激活核酸酶，因而把这种酶称为Caspase激活的脱氧核糖核酸酶（caspase-activated deoxyribonulease CAD），而把它的抑制物称为ICAD。有意义的是CAD只在ICAD存在时才能合成并显示活性，因而ICAD对CAD的活化与抑制是必需要的。破坏细胞结构

10、Caspase可直接破坏细胞结构，如裂解核纤层，核纤层（Lamin）是由核纤层蛋白通过聚合作用而连成头尾相接的多聚体，由此形成核膜的骨架结构，使染色质（chromatin）得以形成并进行正常的排列。在细胞发生凋亡时，核纤层蛋白作为底物被Caspase裂解，从而使核纤层蛋白崩解，导致细胞染色质的固缩。影响核酸的结构与功能 Caspase可作用于多种与DNA，RNA功能有关的蛋白，这些蛋白功能被抑制，使细胞的增殖与复制受阻并发生凋亡。 Caspase的效应机制Nature. 2008 May 29;453(7195):583-5. 19完整版课件pptCaspase-independent sig

11、naling pathways20完整版课件ppt1、线粒体是细胞能量代谢的中心，细胞凋亡过程中对线粒体损伤的最直接结果是其正常功能的丧失。线粒体功能障碍除了会导致自由基产生增加、兴奋性氨基酸释放增多、钙离子超载而引起细胞凋亡外，还能直接诱导细胞凋亡。2、此通路由含BH3结构域的Bcl-2家族成员Bid、Bad、Bim、Harikari、Noxa等在接受到胞内的死亡信号后激活。这些含BH3结构域的Bcl一2家族成员与另外的Bcl一2家族成员(Bax亚家族成员Bax，Bak等，主要松散的结合在线粒体外膜面或存在于胞浆)作用，导致后者的寡聚并插入线粒体膜，引起线粒体膜通透性改变，跨膜电位丢失，释放

12、细胞色素C(Cytc)和其他蛋白。Cytc的释放是线粒体凋亡路径的主要 步骤：在ATPdATP存在的情况下，Cytc与凋亡蛋白酶活化因子(apoptotic protease-activating factor，Apaf-1)形成多聚复合体，通过Apaf-1氨基端的Caspase募集结构域(caspase recruitment domain，cARD)募集胞质中的Caspase-9前体，并使其自我剪切活化并启动Caspase级联反应，激活下游的Caspase-3和Caspase-7，完成其相应底物的剪切，引起细胞凋亡 。Cell. 2007 Nov 2;131(3):476-91.线粒体信号

13、通路21完整版课件ppt Mitochondrial Control of Apoptosis22完整版课件ppt 内质网内钙离子稳态的改变可作用于内质网功能的多个环节，引发细胞凋亡。内质网钙离子的释放在多种凋亡实验中被观察到。内质网的钙释放参与Bad和caspase在不同诱因凋亡中的激活。 破坏内质网内钙离子的稳态可以导致内质网应激，包括内质网超负荷反应，激活凋亡通路。其中内质网超负荷反应以激活转录因子NF-kB为主要特点，启动多种前炎性蛋白和细胞粘附分子的转录表达，对凋亡进行调控。内质网信号通路Science. 2007 Nov 9;318(5852):944-9. 23完整版课件ppt

14、过度内质网应激也可能涉及线粒体及细胞色素C的协同作用而使caspase激活和细胞凋亡。内质网应激介导细胞凋亡调节的一个主要因素是Caspase-12。 在多种疾病的发生发展中，内质网在完成基本生理功能的同时，作为信号传导的枢纽平台，对于细胞凋亡过程发挥着重要的调控作用。24完整版课件ppt Bcl-2家族 Bc1-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物。和一般的癌基因不同，Bc1-2延长细胞的生存，能抑制细胞凋亡,而不是促进细胞的增殖。Bcl-2家族已发现15个成员，所有Bcl-2家族成员均含有1个或多个BH结构域。蛋白含有4个Bcl-2同源结构域，依次命 名为BHl、BH2、BH3

15、和BH4。细胞凋亡的基因调控25完整版课件ppt Bcl-2亚家族： Bcl-2 Bcl-xl Bcl-w、Mcl-1、A1。 Bcl-2亚家族成员对细胞凋亡起抑制作用 Bax亚家族：Bax、Bak、Bok，它们的作用与Bcl-2亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡。 BH3亚家族：Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml、Bad、Bid；仅有BH3结构域。它们的作用也与Bcl-2亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡。 作用机制：影响APAF1的功能 影响线粒体的结构与功能26完整版课件ppt P53是肿瘤抑制基因，其产物主要存在于细胞核内。P53基因是人类肿瘤有关基因中突变频率最高的基因。在依赖

16、P53蛋白的细胞凋亡中，P53基因是通过调节Bc1-2和Bax基因的表达来影响细胞凋亡的。P53蛋白能特异地抑制Bc1-2的表达，相反对Bax的表达则有明显的促进作用。研究表明，P53蛋白是Bax基因的直接的转录活化因子。在这些细胞中，P53蛋白的积累和活动引起了细胞凋亡。P53与细胞凋亡27完整版课件ppt IAP超家族的成员较多，如c-IAP1, c-IAP2,XIAP, NIAP 和Survivin，新的成员在不断的被发现。IAP家族成员有一个共同的特征，含有一个或多个个氨基酸的重复序列（BIR），类似于zinc指状的结构。c-IAP1、 c-IAP2和 XIAP含有环指装结构。BIR功

17、能域和之间的连接区域介导对caspase的抑制作用，而环指状结构则具有泛素化蛋白连接酶的作用，介导caspase-和-的泛素化降解作用。 IAP （Inhibitor of apoptosis，细胞凋亡抑制因子）Gene. 2007 May 1;392(1-2):187-95.28完整版课件ppt29完整版课件pptApoptosis Assays30完整版课件ppt细胞凋亡诱导剂化学诱导剂H2O2化疗药物 物理性因子放射线UV生物因子 Anti-Fas TNF Trail31完整版课件ppt细胞凋亡的形态学变化32完整版课件ppt细胞凋亡的形态学检测方法 光学显微镜 荧光显微镜 (Hoech

18、st 33342，Hoechst 33258, DAPI )电子显微镜 33完整版课件ppt光学显微镜观察34完整版课件ppt荧光显微镜观察35完整版课件ppt电子显微镜观察36完整版课件ppt细胞凋亡的生物化学检测方法磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） TUNEL法DNA片断化检测DNA Ladder 测定DNA含量分析 37完整版课件ppt磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 38完整版课件ppt 不同凋亡阶段的区分39完整版课件ppt流式细胞仪分析（FACS）40完整版课件ppt流式细胞仪定量分析细胞凋亡41完整版课件ppt荧光显微镜定性观察细胞凋亡42完整版课件ppt

19、TUNEL法 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。 43完整版课件pptTUNEL法检测原理：凋亡产生的断裂的DNA-TdT酶标记dUTP-Biotin-结合链霉亲和素-HRP-作用于底物D

20、AB显色44完整版课件pptTunel 原位凋亡检测试剂盒检测方法石蜡包埋组织切片冰冻组织切片固 定脱 蜡水 合 样本通透性的促进(蛋白酶K或Triton-100处理)TdT酶作用下Biotin-dUTP与样本DNA的标记反应加入Streptavidin-HRP及底物DAB的显色反应 光学显微镜观察细胞涂片、贴壁细胞爬片45完整版课件pptTunel 原位凋亡检测试剂盒检测结果46完整版课件pptDNA Ladder 试剂盒检测原理 DNA片段化 激活核酸内切酶 核小体连接区发生DNA降解， 寡核小体片段（160200bp的倍数)检测材料与方法 细胞或新鲜组织，裂解蛋白酶和RNA酶消化提取DN

21、A片段琼脂糖电泳检测结果: 琼脂糖电泳图片47完整版课件pptDNA片断化检测DNA Ladder48完整版课件pptDNA含量分析碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）对细胞进行染色，凋亡细胞由于总DNA量降低，于正常G0/G1细胞群前出现一DNA低染细胞群，即G1峰前出现亚二倍体峰（sub-G1）即细胞凋亡群 DNA Damage2N4N2N4NG1SG2/M49完整版课件ppt细胞凋亡的分子水平检测方法Caspase分子的检测线粒体膜势能的检测JC-1凋亡相关分子的检测促凋亡分子抑凋亡分子相关信号通路分子的检测50完整版课件pptCaspase分子的检测Caspase3、8

22、和9，2，6等51完整版课件pptCaspase检测方法分光光度法检测FACS检测Western Blot检测全长检测剪切体检测52完整版课件pptCaspase分光光度法试剂盒检测原理：活化的Caspase与其特异性底物DEVD- pNA 结合切割，释放出游离pNA，通过测定其吸光度，根据其发光强度的高低代表其活化程度。检测材料与方法 活细胞、新鲜或速深冷冻组织制成的细胞悬液裂解蛋白定量加入底物反应测定吸光度53完整版课件pptCaspase分光光度法试剂盒检测结果：相同蛋白量下受试组与对照组的OD值之比或不同蛋白量OD值的变化曲线图 OD405nm 裂解蛋白量(ug)54完整版课件pptC

23、aspase 3 FACS检测55完整版课件pptCaspase 3 Western Blot检测56完整版课件ppt通过对Caspase底物PARP等的降解产物的检测反映Caspase的活性。 通过针对Caspase 催化的降解产物采用IHC、Western Blot、FCM进行检测。 116Kd Full length PARP85Kd Cleaved PARP57完整版课件ppt原理： JC-1染料在正常细胞内聚集在线粒体内，形成多聚体，发红色荧光；而在凋亡细胞内，由于线粒体膜电位的破坏，不能聚集到线粒体内，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。线粒体膜势能（ JC-1 ）的检测荧光显微镜

24、检测FACS检测58完整版课件pptJC-1线粒体膜电位检测试剂盒检测结果： 59完整版课件ppt线粒体膜势能的检测(JC-1)60完整版课件ppt凋亡相关分子的检测促凋亡分子Bax, Bcl-Xs, Bak, Bad, Bid, AIF,Apaf-1和cytochrome c等抑制凋亡分子Bcl-2, Bcl-XL和bcr/abl kinase等端粒酶活性检测试剂盒氧化应激系列检测 61完整版课件ppt62完整版课件ppt相关信号通路分子的检测抗凋亡信号通路PI3K-Akt pathwayNIK-NF-kB pathway促凋亡信号通路MKK-JNK pathwayFas-FADD path

25、wayP53 pathway63完整版课件ppt凋亡分析总体原则凋亡分析总体原则：1）因为凋亡是多因素、多通路参与的过程，不能根据单一指标来判断细胞凋亡；所以需进行多指标同时检测；2)由于凋亡细胞不同时间出现的凋亡事件不同；而每个指征维持有一个时间段，所以需要在不同的时间点进行采样，以保证检测结果的准确性；3）实验需要设定阳性和阴性对照，避免出现假阳性或者假阴性。64完整版课件ppt综合解决方案凋亡或坏死？ 死亡受体通路或线粒体通路？ 具体的调控分子机制Annexin VTunelDNA contentCaspase 3, 8, 9JC-1 stainBax/Bcl-2Cytochrome C

26、JNK pathway65完整版课件ppt 研究目的 检测指标 产品选择指南1 AO/EB、Hoechst33258、 PI、DAPI、 Hoechst33342/PI、罗丹明123试剂盒2 AnnexinV-FITC/EGFP3 TUNEL、DNA ladder试剂盒4 Caspase 试剂盒1 AnnexinV-FITC/EGFP2 细胞周期检测试剂盒C：判断凋亡信号通路：是内源线粒体通路？还是外源死亡受体通路？或内质网通路？1线粒体通路：JC-1、 Caspase 9活性等2死亡受体通路：Caspase 8活性等3内质网通路；Bap31等 1 JC-1；Caspase9试剂盒2 Casp

27、ase8试剂盒、蛋白抽提 蛋白定量试剂盒3 KGP系列（WB/免疫组化）D：判断各通路具体的分子调控机制1 MYC通路（P53 AIF等）2 NF kappa B 通路3 JNK通路4 ARK通路1 RT-PCR试剂盒等分子生物学系列2 EMSA试剂盒3 KGP系列（蛋白抽提、蛋白定量）4 KGP系列（WB）5 KGP系列（免疫组化）1 Annexin V流式细胞仪分析2 DNA含量分析等B：判断凋亡的时期或数量（定量分析）A： 判断细胞的死亡是凋亡？还是坏死？（定性分析）1 细胞形态学观察2 Annexin V荧光分析3 TUNEL/ DNA Ladder分析4 Caspase 3活性分析6

28、6完整版课件ppt根椐实验材料类型选择检测方法和产品 实验材料类型检测方法或产品1 细胞 Annexin V-FITC/EGFP， Caspase，JC-1，TUNEL，DNA Ladder等2 新鲜组织Caspase，WB等相关产品3 冷冻组织Caspase ，TUNEL，WB等相关产品4固定组织 石蜡切片TUNEL法，免疫组化法67完整版课件ppt常见问题及解决方法1 试验前阶段 凋亡指标的选择及实验方案的设计 A 实验材料：类型与数量 B 仪器条件 C 研究经费 D 论文水平68完整版课件ppt常见问题及解决方法2 试验阶段 A 自备试剂浓度，配制方法 B 操作经验及注意事项 C 根椐具

29、体材料的试验条件优化3 结果分析 A 阴性：没结果 B 阳性：假阳性 C 结果不明显 D 结果异常69完整版课件ppta、确定细胞凋亡发生的时间，PS外翻只发生在细胞凋亡早期，建议先观察细胞凋亡的形态后决定取样检测时间。b、由于EDTA会络合Ca2+离子，影响Annexin V与PS的结合，因此建议不用含EDTA的胰酶消化贴壁细胞。d、因为细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。b、细胞经过胰酶消化后可能导致胰酶对细胞的进一步作用从而导致细胞的进一步凋亡，建议胰酶消化后的细胞保存在2的BSA中。Annexin V凋亡检测常见问题70完整版课件ppt问题可能原因解决方案非特异性染色（例如：

30、非凋亡细胞的强染色）Biotin-dUTP的非特异性结合勿使细胞干涸在TdT酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。TdT酶的浓度过高用TdT dilution buffer* 作1：21：10稀释，内源过氧化物酶未被封闭封闭液室温（15）封闭10min（封闭液： 3%H2O2溶于甲醇）光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂）尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂在固定组织时样本DNA已断裂（内源核酸酶的作用）确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂用含有dUTP和 dAP

31、T的溶液封闭TUNEL检测常见问题71完整版课件ppt问题可能原因解决方案染色背景较高福尔马林固定导致某些含黑色素前体的细胞染成黄色尝试以甲醇固定，但可能会降低检测的敏感性。内源过氧化物酶未被封闭封闭液室温（15）封闭10min（封闭液： 3%H2O2溶于甲醇）Biotin-dUTP的非特异性结合在TdT酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。样本被支原体污染使用支原体检测试剂盒检测，如阳性则制备未被污染的新样本标记反应试剂（TdT酶及dUTP）的浓度过高稀释50%，以降胝的标记反应的浓度细胞处于高度增殖期在非高增殖期取样检测DAB孵育时间

32、过长减少DAB染色时间72完整版课件ppt问题可能原因解决方案标记率低、染色淡至无如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失）用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定或福尔马林或戊二醛固定。过度的固定导致与蛋白过度交联缩短固定时间，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定促渗条件不佳，以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低增加通透剂促渗时间增加通透剂的作用温度（15）优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间（如：以400ug/ml作用5min）的柠檬酸钠作用30min。73完整版课件ppt问： 电泳结果中DNA 片段模糊，得不到清晰的Ladder，原因是什么？答：可以考虑以下原因： 细胞凋亡进行过度，有非特异性的DNA 片段。推荐提早取样时间。 操作中混入DNase。应防止DNase 混入（如实验戴手套等）。问：电泳结果无DNA 片段检出，为什么？答：可以考虑以下原