罗氏第一链cDNA合成试剂盒TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit中文说明书

1、反应次数目录号反应次数04 379 012 00150次，包括10次对照反应04 896 866 001100次04 897 030 001200次试剂盒包装与含量小瓶/瓶盖标签适用 于 a) 04 379 012 001 b) 04 896 866 001c) 04 897 030 001 1红色TranscriptorReverseTranscriptase (逆转录酶)1 瓶，25l (20 U/l)1 瓶，50l (20 U/l)2 瓶，各 50 l (20 U/ l)储存缓冲液：200 mM 磷酸钾，2 mM 二 硫苏糖醇，0.2% Triton X-100(v/v) , 50% 甘

2、油(v/v) , pH约为7.2 2无色Transcriptor RTReaction Buffer(5 ) x (逆转录缓冲液)1 瓶，1 ml1 瓶，1 ml2 瓶，各 1 ml5xB度：250 mM Tris/HCl ,150 mM KCl , 40 mM MgCl2 , pH 约为 8.5(25 C) 3无色ProtectorRNase Inhibitor(RNase抑制剂)1 瓶，50l(40 U/ l)1 瓶，100l(40 U/ l)2 瓶，各 100l(40 U/ l)储存缓冲液：20 mM Hepes-KOH , 50 mM KCl , 8 mM 二硫苏糖醇，50 % 甘油

3、(v/v) , pH 约为 7.6 (4 C) 4黄色/紫色Deoxynuc-leo-tideMix(dNTP )1瓶，100黄色瓶盖)1瓶，200紫色瓶盖)2瓶，各200 紫色瓶盖)dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各 10 mM 5蓝色Anchored-oligo(dT)18Primer(锚定 oligo(dT)18 引物)1 瓶，100l(50 林 M)1 瓶，200l(50 林 M)2 瓶，各 200l(50 林 M)6Random Hexamer1 瓶，100l(600 林 M)蓝色Primer (随机引物)1 瓶，200l(600 林 M)2 瓶，各 200l(600

4、林 M)7绿色Control RNA(对照RNA)a) 1 瓶，20l(50 ng/ l)包含提取于永生细胞系(K562)的总RNA 片段稳定溶液8绿色Control Primer Mix PBGD(对照基因引物)a) 1 瓶，40 口5 M人类PBGD特异性正向与反向引物9(b和c为瓶7)无色Water, PCR-grade1 瓶，1 ml2 瓶，各 1 ml3 瓶，各 1 ml注意：货号为 04 896 866 001 和04 897030 001的产品不含有 control试剂(瓶7 和瓶8),因此瓶7即为 Water, PCR-grade 。 储存条件及其稳定性请将该产品存放于-15-

5、25 C条件中，并 于产品标签上的有效期之前使用。注意：Control RNA(货号 04 379 012 001 的瓶7)应储存于-70 C条件。请避免将产品反 复冻融！2产品使用方法实验前准备样本材料RNA模板：分离的总 RNA, mRNA,病 毒RNA或体外转录的RNA。注意：想要得到较好的 RT结果，使用高 质量完整的RNA(不含基因组DNA残留、 RNA酶、抑制剂)是必要的。请根据以下 预防措施进行操作，避免使 RNA在分离 过程中受到RNA酶的污染(从细胞裂解开 始)：-使用RNA酶抑制剂(如Protector RNase Inhibitor)或在使RNA酶失活的分 离条件下进行操

6、作。-如果有必要，用凝胶电泳分析过程中不 同步骤(裂解、分离)以确保样本中不含有 RNA 酶。-请记住RNA酶也可能出现在受到污染 的玻璃容器中。为了准备总RNA或mRNA ,我们建议您 使用罗氏应用科学部的试剂。为了筛选出 能够产生高质量的适用于 RT-PCR的完 整RNA模板，请参考第3部分。补充信 息：想了解订货信息或查看相关核酸分离 纯化指南，请访问 HYPERLINK /napure /napure.想了解关于使用 MagNA Pure LC System 或 MagNA Pure Compact System进行核酸自动分离的更多信息， 请访问 HYPERLINK .引物六聚物随机

7、引物在常规的RT反应中，使用5g的总RNA 模板，可采用60的随机引物终浓度。使用5人总RNA并增加随机引物浓度， 将增加短片段PCR产物(的产率，但是 相应地，长片段PCR产物及全长转录子 的产率会降低。在非特异引物的反转录方 法中，随机引物法是最多使用的一种方法， 其特异性的扩增产物只能通过后续的 PCR反应中使用特异的 PCR引物获得。锚定oligo(dT)18引物.锚定oligo(dT)18引物特异性地结合在带 有poly(A)+的RNA片段上，这类片段通 常只占总RNA的1-2%,因此用锚定 oligo(dT)18引物进行反转录所获得的 cDNA产率大大低于随机引物方法。如果 实验是

8、为了获得新 mRNA的RT-PCR产 物，则推荐使用锚定oligo(dT)18引物。 使用该方法获得的RT-PCR产物具有较 强的一致性。特异性序列引物使用特异性序列引物，其终浓度推荐为 2Mo但是请注意，即使这些引物在以 DNA作为模板的PCR反应中成功获得扩 增产物，相同的引物序列却可能难以定位 在cDNA片段上。如果遇到此类情况，请 使用锚定oligo(dT)18引物重新进行第一 链合成反应。实验流程标准RT-PCR流程在此提供两种不同的操作流程：A:反转录使用锚定 oligo(dT)18引物或 六聚物随机引物或特异性序列引物。在大 多数情况下，只选择其中的一种引物进行 cDNA合成。B

9、:反转录使用oligo(dT)18引物和六聚 物随机引物的混合物。这种方法可提高反 应敏感度，但与使用单一 oligo(dT)18引 物比起来反应特异性会降低。注意：根据您使用的引物类型，参考以下 给出的流程A与B。流程A:使用锚定oligo(dT)18引物或六 聚物随机引物或特异性序列引物合成cDNA。以下描述的条件适用于两步法RT-PCR的第一链cDNA合成。图1为单一反应和 多重反应中cDNA合成流程概述。单一反应 多重反应RNA+引物+水可选：变性10min 65 C冰上配置多重 RT反应混合液(除RNA模 板)并分装到各反应管添加模板RNA到每个反应管中置于冰上，添加缓冲液，RNas

10、e Inhibitor , dNTPs , Transcriptor RT锚定oligo(dT)18引物/特异性序列引物30min 55 C 或 1h 50 C六聚物随机引物10min 25 C30min 55 C 或 1h 50 C85 C 失活 5min添加1-5 至PCR体系或 RT-PCR体系 准备cDNA合成图1:单一反应和多重反应中 cDNA合成 流程概述 TOC o 1-5 h z 使用前先将所有冷冻试剂解冻。开始实验前将所有试剂轻度离心。实验开始后保持将所有试剂置于冰上。,将无菌、无核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，以20反应体系为例，按照以下组分准备模板-引物混合物。注意：进

11、行与RNA相关的操作时请保持 配戴手套。模板-引物混合物(1次反应)成分体积最终浓度总RNA或poly(A)+ mRNA1g总.RNA 或10 ng poly(A)+ mRNA 引物-以下任选其一：Anchored-oligo(dT)18 Primer, 50pmol/ l瓶 5)1 (1 12.5 叱 M Random Hexamer Primer,600 pmol/ 版 6)2160或 Sequence-Specific Primer可变0.5-2.5 小Water, PCR-grade (并7 或 9)可变使总体积为13 1总体积131以上为初实验的建议浓度。为了得到合适 的模板浓度，需

12、要使总RNA的量在10 ng 到5(1拉间，使 mRNA的量在1 ng至U 100ng之间。注意：当RNA样本浓度较低( 10 /ml) 时，添加10猿g/ml MS2 RNA*以使RNA 模板稳定。可选步骤：在65C条件下加热反应管10min使模板-引物混合物变性。此步骤可确保RNA二级结构变性。立即将反应管置于冰上冷却。在含有模板-引物混合物的反应管中加入下表中其余的RT反应液组分。成分 体积最终浓度Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer, 5(瓶 2)411 x(8 mM MgCl2)Protector RNase Inhib

13、itor,40 U/ 瓶 3)0.5 猿 120 UDeoxynucleotide Mix, 每种dNTP各10 mM(瓶4) 21每种dNTP各1 mMTranscriptor Reverse Transcriptase,20 U/3版 1)0.5 猿 110 U最终体积20林1在反应管中将试剂小心混匀。注意：不要旋涡！将反应管轻度离心使样本收集于反应管 底部。反应时使用带热盖的加热模块，防止反 应管中的液体挥发。根据您所使用的引物以及目标 mRNA的 长度，RT反应孵育时间参考下表： 使用 的引物目标mRNA的长度RT反应孵育 时间Anchored-oligo(dT)18 Primer,

14、50pmol/l或 Sequence-Specific Primer不超过4 kb55 C 下 30min超过4 kb50 C 下 60minRandom Hexamer Primer, 600 pmol/ 叱 1 不超过4 kb25 C 下 10min , 之后55 C下30min超过4 kb25 C 下 10min , 之后50 C下60min加热至 85 C 维持 5min 使 Transcriptor Reverse Transcriptase 失活。*将反应管置于冰上以终止反应。反应管在+2+8 C下可保存1-2小时，在-15-25 C下可保存更长时间。此cDNA产物无需经过纯化即可

15、用于PCR反应。一般来说，使用1-5第一链cDNA作为模板加入PCR体系中。若是最初的实 验，可尝试在504PCR体系中使用24 cDNA作为模板。如果在 LightCycler System 上进行 PCR , 在204的反应体系中使用 2-54cDNA 或cDNA稀释液。注意：逆转录反应工作液中 MgCl2的最终浓度为8 mM ,因此PCR反应混合液中每l的cDNA反应液模板带入了 8 nmolMgCl2,根据实际需要优化反应液中的MgCl2浓度。Transcriptor Reverse Transcriptase 具有 RNaseH活性。在cDNA合成结束后 RNaseH可除去RNA模板

16、，这使得PCR 引物更容易与cDNA结合，在某些情况下， 这会提高PCR反应的灵敏度。流程B:使用锚定oligo(dT)18引物和六 聚物随机引物合成cDNA。以下描述的条件适用于两步法RT-PCR的第一链cDNA合成。 TOC o 1-5 h z 使用前先将所有冷冻试剂解冻。开始实验前将所有试剂轻度离心。实验开始后保持将所有试剂置于冰上。将无菌、无核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，以20反应体系为例，按照以下组分准备模板-引物混合物。注意：进行与RNA相关的操作时请保持 配戴手套。模板-引物混合物(1次反应)成分体积 最终浓度总RNA或poly(A)+ mRNA1 g总RNA或10 ng p

17、oly(A)+ mRNA Anchored-oligo(dT)18 Primer, 50 pmol/ w l瓶 5)1 (1 12.5 卜 MF口 Random Hexamer Primer,2 (1 160600 pmol/ 瓶 6)Water, PCR-grade (并7 或 9)可变使总体积为13 1 总体积131以上为初实验的建议浓度。为了得到合适 的模板浓度，需要使总RNA的量在10 ng 到5(1拉间，使 mRNA的量在1 ng至U 100ng之间。注意：当RNA样本浓度较低( LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green*、LightCycler 480 SYBR Green I Master* 相关使用说明。常规热循环仪PCR根据以下流程准备50标准反应体系。在彳&RT对照反应管之余，以水替代cDNA 模板加入反应体系作为阴性对照。使用前先将所有冷冻试剂解冻。开始实验前将所有试剂轻度离心。实验开始后保持将所有试剂置于冰上。将薄管壁的PCR管置于冰上，配置501的PCR反应体系，在同一反应管中依次加 入下表中各个组分。成分体积最终浓度含 20 mM MgCl2 的 FastStartBuffer(10 X5 (1 11 xPCR Nucleotide Mix*(10 mM)(1