2015研究生实验4-电泳与紫外

1、2015级研究生生化与分子生物学技术1. 重组质粒的酶切后的电泳鉴定(P28)2. 紫外分光光度法检测DNA含量 (P37)实验二原理 在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、分子量、构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。31、酶切质粒DNA后的琼脂糖凝胶电泳影响DNA在凝胶中迁移速率的因素： DNA分子的大小 构象 凝胶浓度 电压 缓冲液不同浓度琼脂糖的

2、凝胶分离范围琼脂糖浓度（，W/ V ) DNA分子的有效分离范围（kb)0.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-2 实验材料及试剂 琼脂糖 电泳缓冲液：1TAE 10 加样缓冲液 EB染色液 实验步骤1、胶带封制胶板两端；2、放好梳子，今天插2个梳子,等胶稍稍冷却后灌胶；3、待胶凝固后撕去胶带，将制胶板放在电泳槽中，轻轻的拔掉梳子；4、加样：每排第一个孔加 DNA marker 10 l （酶切组：酶切质粒20ul和4l loading buffer在胶带上混匀上样） (对照组：用酶切前的质粒10ul和2l loading buffer在胶带上

3、混匀上样,每组1个)；5、接通电源，开始电泳（80V，1H）;6、蓝色条带快到终点时停止电泳，EB染色5min，洗脱3min；7、漂洗后紫外灯下观察结果。7实验小结结果分析与讨论酶切前后的对比？质粒构型对结果的影响？重组质粒的浓度是多少？纯度怎样？试验中还有哪些问题没有解决？8点样孔细菌基因组DNAOC 型质粒DNAL型质粒DNASC 质粒DNA细菌RNA质粒电泳图谱 超螺旋DNA(SC DNA)质粒的三种构型10 开环DNA(open circular DNA,OC DNA) 如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。11 线状DNA(linea

4、r DNA,LC DNA): 如果两条链均断开，即为线状DNA。电泳时，三者泳动速度大小关系 SCLCOC12电泳结果分析M：Marker1：酶切样品12：酶切样品23：酶切样品34：未酶切质粒M3211Kb200bp100bp2Kb5Kb600bp400bp4二、紫外分光光度法检测DNA2.1 分光光度技术2.1.1 概述 分光光度技术是利用物质特有的吸收光谱对其进行定性、定量分析的实验技术。142.1.2 特点 灵敏度高：测定下限可达105106mol/L准确度高：能够满足微量组分的测定要求，相对误差25 （12）;操作简便快速;应用广泛。152.2.2 光吸收基本定律: Lambert-

5、Beer定律透光度百分比 T: T% = I0 / It光密度 D，是光被吸收的程度: D = lg1/T = lg(I0/It)16Lambert-Beer定律 DK C L 吸光度 摩尔消光系数 吸收物质的光径（cm） 溶液浓度（mol/L）172.4 紫外分光光度法检测DNA2.4.1 紫外分光光度法检测DNA的原理原理：核酸分子含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260nm处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸浓度成正比。优点：简单、快速、灵敏、样品可以回收。缺点：有一定的误差（原因）；受蛋白类物质干扰。182.4.2 实验步骤：0.1TE作为空对照,在波长260nm、280nm、310nm处分别测标准DNA样品的OD值根据OD值计算DNA浓度（ g/ml）单链DNAssDNA=33(OD260OD310)稀释倍数双链DNAdsDNA=50(OD260OD310)稀释倍数4. DNA的纯度鉴定 OD260/ OD280=1.8 （RNA为