香花槐根、茎、叶总RNA提取方法的改良和优化

1、香花槐根、茎、叶总RNA提取方法的改进和优化论文导读:：为探索香花槐各组织总RNA提取的最正确方法，以实验苗圃中的香花槐为实验材料，在比拟了Trizol试剂法和常规CTAB法的根底上，建立了香花槐不同组织的最适提取方法。改进CTAB法利用高浓度的-巯基乙醇和适宜浓度的PVP来防止RNA提取过程中多酚的氧化，然后增加苯酚/氯仿抽提次数来去除香花槐叶片和茎皮过多蛋白质。改进Trizol试剂法在根皮中加PVP研磨成白色粉末，可以有效地防止反响液褐化。各组织优化方法经琼脂糖凝胶电泳检测，所提取的总RNA的28S、18S条带清晰明亮，无降解；其A260 nm/A280 nm值为2.0，说明提取的总RNA

2、质量较好。论文关键词：香花槐，多糖，多酚，总RNA，组织1996年从朝鲜引入中国【1】(JUNFAR香花槐(2005-10-05) ：llwww1andscape66complantahiwu2005103526htm1) 。香花槐速生，花紫红色，总状花序壮观，开花时间57月，花期长；根系强健，萌蘖更新能力强，有根瘤菌，能固氮，耐旱耐瘠薄，也耐盐碱多糖，喜沙质土壤，并可有效地保持水土，改善生态环境。是城市绿化、美化、沙化及流域治理、荒山荒地生态修复的先锋树种【2】【1】。在基因水平上了解该树种生长发育；开展遗传转化品种改进的研究已得到了重视。相关分子生物学和工程技术研究，Northern杂交分

3、析、体外翻译或cDNA文库建立、RT-PCR及表达差异分析等亟高质量的RNA【3】【2】。植物组织总RNA提取方法的报道很多, 且Yoshida曾报道香花槐凝集素cDNA的克隆，这为香花槐不同组织RNA提取方法的建立和优化提供了丰富资料【4】【3】。同时考虑到植物组织特异性，不同材料甚至同一材料不同发育阶段，RNA的提取方法也不尽相同。本文以香花槐根、茎、叶等不同器官为试材，以Trizol、CTAB等提取方法为根底建立和优化其RNA提取方法，为其分子生物学研究和生物工程技术需要奠定根底中国期刊全文数据库。1 材料和方法1.1材料和试剂供试材料香花槐Robiniapsuedoacacia Ida

4、ho采自为北京林业大学生物中心苗圃。4-5月，植株萌芽生长，采集嫩叶、茎和根部皮层和幼嫩根尖，液氮冷却、80 贮存备用。DEPC水:体积分数为0.1%；CTAB裂解缓冲液；苯酚、氯仿、异戊醇25：241(体积比)混合； 75%的乙醇(v/v)；LiCl 10mol/L；SSTE溶解液(DEPC水配制)。实验中所用的玻璃器皿与用具均在180下烘烤12 h，塑料制品在含0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)的水中，37浸泡12 h，然后121灭菌30 min，60烘干备用。1.2提取方法表1香花槐总RNA提取方法 编号No 抽提次数 Times of extraction -巯基乙醇(% ) Conc

5、entrations of -mercaptoethanol PVP(% ) Concentrations Of PVP 1 2 2 2 2 2 2 4 3 2 2 8 4 2 4 2 5 2 4 4 6 2 4 8 7 3 2 2 8 3 2 4 9 3 2 8 10 3 4 2 11 3 4 4 12 3 4 8 13 4 2 2 14 4 2 4 15 4 2 8 16 4 4 2 17 4 4 4 18 4 4 8 Total RNA isolation basedon CTAB method in Robinia pseudoacacia Idaho 4-1 4-2 4-3 .3 R

6、NA完整性分析从表1所述方法得到的RNA中取6 uL进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。1.4 RNA得率及纯度以微量分光光度计SMA3000型测量RNA样品的OD260、OD230、OD280和RNA浓度,以OD260/OD280、OD260/OD230的比值检测RNA纯度。按照以下公式计算RNA产率：产率g/ g=样品浓度(g/ml)xN(样品稀释倍数)xV(体积) /样品重(g)本实验用相同质量的组织为研究对象，同时提取后的RNA溶解于相同体积的DEPC水中，因此样品浓度的大小就反响了个组织材料的产率大小。2结果与分析2.1 2种TRIZOL法提取RNA的比拟RNA的完整性：总RNA的主要成分是

7、28S RNA和18S RNA，因此，根据琼脂糖凝胶电泳图上28S和18S RNA的完整性可以判断RNA有无降解及有无DNA污染。 图1显示，Trizol法提取的总RNA样品只有根组织有条带，28S rRNA条带亮度与18S rRNA几乎一致，没有呈现出28SrRNA条带亮度为18S rRNA条带亮度2倍的状况；茎和叶片提取的总RNA无清晰条带出现，而点样孔周围亮，可能有大片段DNA污染；该方法不适合用于提取香花槐RNA。改进Trizol法，在根皮中参加PVP研磨，粉末白色，有效防止褐化图3这是由于Trizol试剂中含有苯酚，它是一种强氧化剂，能将根皮组织中的多酚类物质氧化，从而发生了褐化效应

8、反响。在本研究中发现Trizol一次法并不能非常完整有效地去除细胞中的蛋白质，在第1次沉淀溶解后，再用氯仿重新抽提1次获得的RNA。同时，为了除多糖和蛋白成分更彻底多糖，增加了在抽提过程中参加等体积的苯酚、氯仿、异戊醇25：241 (体积比)混合液，28 S和18 S条带均清晰可见，且条带明亮，28 S条带的亮度约是18 S条带的两倍，说明提取的RNA无降解，质量好，且无DNA污染图2。图2说明，常规Trizol法提取的根组织总RNA样品，在琼脂糖凝胶电泳点样孔附近显示明亮条带，说明有大分子蛋白或DNA污染中国期刊全文数据库。与此相比，改进TRIZOL法去除了根皮总RNA提取的干扰，提取效率高

9、，为香花槐根皮总RNA提取的首选方法。 1 2 3 4 5 6 28S 18S 5.8S 28S 18S 5.8S 1 2 3 4 5 6 图1 TRIZOL法提取香花槐各组织的总RNA凝胶电泳1,2根皮 ；3,4枝皮 ；5,6叶片Fig-1Agarosegel electrophoresis of total RNA isolated from different tissues w ith Trizolmethod1,2 1,2根皮 Roots；3,4枝皮Barks ；5,6叶片 Leaves 1 2 28S 18S 5.8S 图2 2种Trizol法提取香花槐根皮组织的总RNA凝胶电泳1

10、改进Trizol法; 2 Trizol法Fig-2Agarose Agarose gel electrophoresis of total RNAisolated from different tissues w ith two trizol method1 1改进Trizol法improved Trizol method；2Trizol法 2 Trizol method 23-1 23-2 图23改进Trizol法中根皮与裂解液作用的结果3-1加PVP裂解粗提物 3-2不加PVP裂解粗提物Fig-23Comparison of colors of coarse extracts by imp

11、roved Trizol method3-1 2-1加PVP裂解粗提物2%PVP；2-2不加PVP裂解粗提物 3-2 No PYP2.2提取香花槐RNA的改进CTAB法本试验着重对CTAB法进行了改进。以幼嫩叶片为试验材料，不同处理方法提取的总RNA经进行紫外分光光度计测定，结果见表2、表3。综合表2、表3显示当PVP浓度为2%时，RNA的平均产率为243.25g-mL-1显著高于浓度为4%、8%时的产率209.25g-mL-1、174.67g-mL-1,随着PVP浓度的升高，RNA纯度逐渐增高，但RNA产率却开始下降，说明PVP在去除多酚等杂质时，使RNA也被结合而丧失了，但其OD260/O

12、D230和 OD260/OD280的比率都在2.0左右。PVP与酚类化合物(特别是原花色素类物质)形成鳌合物，使之不能成为多酚氧化酶的底物而抑制它们的氧化。3种不同浓度的PVP所获得的第一次抽提产物的颜色比拟见图4。图4结果说明，PVP可以有效地防止底物的褐化多糖，结合表2本实验说明PVP的浓度在2%时无论是RNA产率，还是OD260/OD230和 OD260/OD280的比率都是最理想的。所以在能保证RNA质量的前提下，应适当降低PVP的浓度，试验认为2%即可作为PVP的适宜浓度。2%和4%-巯基乙醇两个处理中RNA产率变化不显著，但4%处理可明显提高RNA的纯度，所以本试验认为-巯基乙醇最

13、适浓度为4%。表2不同组合提取RNA的结果比拟Table2 Comparison of RNAisolation from Robinia pseudoacacia Idaho by different treatments of improved CTAB method 编号No D260/280 D260/230 浓度/(g-mL-1) concentration 1 1.32 0.69 256.80 2 1.94 1.74 236.70 3 1.89 1.82 201.30 4 1.75 1.63 265.90 5 1.94 1.89 253.30 6 2.13 2.05 211.30

14、7 2.57 2.47 200.60 8 2.08 2.14 190.30 9 2.11 2.06 173.70 10 1.99 2.87 247.20 11 2.15 2.98 210.40 12 2.09 2.45 159.70 13 1.94 2.17 260.10 14 1.91 2.01 198.90 15 1.97 1.96 142.10 16 1.99 2.81 228.90 17 2.02 2.78 165.90 18 2.1 2.13 159.90 表3不同处理提取RNA平均纯度、产率及其差异显著性Table3The average purity and concentrat

15、ionof RNA isolated from leaves by different treatments of improved CTAB method 处理 Treatment D260/280 D260/230 浓度/(g-mL-1) concentration 抽提2次 1.83b 1.64b 237.55a 抽提3次 2.17a 2.50a 196.98b 抽提4次 1.99b 2.31a 192.63b 2% PVP 1.93a 2.11a 243.25a 4% PVP 2.01a 2.26a 209.25b 8% PVP 2.05a 2.08a 174.67b 2%巯基乙醇 1

16、.97a 1.90b 206.72a 4%巯基乙醇 2.02a 2.48a 211.39a table11图4 3种浓度的PVP获得的第一次抽提产物的颜色比拟Fig-4Comparison of colors of the first coarse extracts with different concentration of PVP4-1 2%PVP4-2 4%PVP4-3 8%PVP 5-1 5-2 5-3 图5 不同抽提次数产物的颜色比拟5-1抽提一次 5-2抽提两次 5-3抽提三次Fig-5Comparison of colors of different times of extr

17、action5-1extraction byone tme 5-2 extraction by two tmes 5-3 extraction by three tmes据测定，香花槐茎叶中分别含粗蛋白21%-25%，是一种速生、高产、优质的木本饲料。在提取的过程中应该加强对蛋白的去除，防止蛋白对下游工作的影响，因此本实验选用增加抽提次数来比拟蛋白的去除，结果如图5和表2，表2显示随着抽提次数的增加RNA含量会有所降低，但其OD260/OD230和 OD260/OD280的比率是越来越理想2.0左右，图5也说明不同抽提次数的离心产物也显示越来越透明澄清。考虑到RNA的得率及其OD260/OD2

18、30和 OD260/OD280的比率，所以选择抽提次数2次为最适的抽提次数。综合以上结果，对香花槐而言，改进CTAB法的最适提取液组成为: 2%CTAB, 4mol/L异硫酸氰胍，100mmol /L Tris-HCl ( pH8.0 )，20mmol/L EDTA(pH8.0), 2% PVP, 4%-巯基乙醇。在抽提过程中选择抽提次数2次，在以下香花槐茎皮和叶片组织的改进CTAB法中均采用此方法。2.3不同组织的RNA提取方法比拟以改进的TRIZOL法提取香花槐根皮，以改进CTAB法提取香花槐叶片和茎皮结果如下列图6。图中显示提取的RNA28S条带的亮度约是18 S条带的两倍，蛋白、多酚及

19、多糖类等杂质污染较少，均符合后续分子生物学的试验要求中国期刊全文数据库。 M 1 2 3 图6不同方法提取香花槐不同器官与组织的总RNA琼脂糖凝胶电泳图谱Fig-6Agarose gel electrophoresisof total RNA isolated from different tissues or organs with different methodsM：mark；1:改进Trizol试剂法提取根皮; 2,3:改进CTAB法分别提取的叶片和茎皮3 讨论由于不同植物或同一植物不同组织的组成成分差异较大多糖，所以对于不同植物或同一植物不同组织的RNA提取方法也有所不同【5】【4】

20、。31 RNA提取需要注意的问题 实验过程中要严格控制无酶的环境，所用试剂都需要灭酶处理，实验人员要带一次性手套和口罩，整个过程尽量在超净台工作，超净台要提前30 min用紫外灯照射消毒，以减少RNase的污染。液氮研磨过程中要研磨彻底，否那么影响细胞的破裂完全，提出的RNA量少或提不出。特别对于比拟坚硬的根皮组织可以事先在液氮中冷冻两小时以上再研磨。32 防止酚类氧化 香花槐含有大量酚类化合物，在提取过程中十分容易氧化，导致提取过程中组织颜色逐渐加深变成褐色，严重影响了所提的RNA的质量，其主要原因是由于酚类化合物氧化后不可逆地结合到核酸上并与RNA共沉淀。为解决酚类氧化问题，用-巯基乙醇作

21、为复原剂，用PVP作鳌合剂能够提高RNA的质量，减轻氧化而产生的背景颜色。33 克服蛋白质污染 香花槐含有大量的蛋白，尤以茎叶组织中蛋白含量较多，在提取缓冲液中参加蛋白质变性剂，如异硫酸氰胍、盐酸呱、巯基乙醇, 十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)等使蛋白质变性完全,细胞裂解彻底，从而将RNA完全释放出来，同时可去除大局部蛋白质，最后再用苯酚/氯仿屡次抽提除去残存的蛋白质和DNA。经过上述改进的Trizol试剂法、CTAB法产率和质量均有显著改善，而且在香花槐的不同组织材料中具有较好的适用性。既使有适宜的方法，试验材料也会对RNA的提取造成很大的限制多糖，应根据试验要求选择适宜的材料，以到达最正确

22、效果。本实验于4月中旬，以香花槐幼嫩组织为试材提取RNA，产率和质量均较高。参考文献【2】 刘昀，李凤霞，郑易之，郝东时，高天舜，朱冬梅，何孟元. 香花槐组培苗快繁体系的建立及工厂化育苗的主要影响因素. 应用与环境生物学报. 2004, 10(2): 162-165.【3】 李宏，王新力. 植物组织RNA提取的难点及对策. 生物技术通报. 1999, 15(1): 36-39.【4】 Yoshida K, Baba K,Yamamoto N, et al. Cloning of a lectin cDNA and seasonal changes in levels ofthe lectin

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