药典三部2015版-通则-3604新生牛血清检测要求

1、3604新生牛血清检测要求本品系从出生14小时内未进食的新生牛采血分离血清，经除菌过滤后制成。牛血清生产过程中不得任意添加其他物质成分。新生牛血清应进行以下检查，符合规定后方可使用。如采用经过验证的病毒灭活工艺处理的牛血清，大肠杆菌噬菌体 及病毒检测必须在灭活前取样进行。pH值 应为7.008.50。蛋白质含量 采用双缩月尿法（通则0731第三法）或其他适宜方 法测定，应为3550g/L。血红蛋白用分光光度法或其他适宜的方法测定，应不高于200mg/L。以蒸储水为空白对照，使用 1cm光路的比色杯，直接测定供试 品在576nm、623nm及700nm波长下的吸光度值，每个供试品至少 测定2次，

2、计算平均测定值。按照下式计算供试品中血红蛋白含量：血红蛋白含量（mg/L）=（A 576 M15）（A623X102）（A700M9.1） 10 式中 A576、A623、A700为供试品在576nm、623nm及700nm波长下 的平均吸光度值。渗透压摩尔浓度应为250330mOsmol/kg （通则0632）。细菌内毒素检查应不高于10EU/m l（通则1143凝胶限度试验）支持细胞增殖检查 用Sp2/0-Ag14或适宜的传代细胞进行。细 胞复苏后，用待测样品配制的培养液至少连续传三代后使用， 取对数 生长期的细胞用于试验。（1）细胞生长曲线的测定 取供试品按10%浓度配制细胞培养 液，按

3、每1ml含104的细胞浓度接种细胞，每天计数活细胞，连续观 察1周，并绘制生长曲线，细胞的最大增殖浓度应不低于106/ml。（2）细胞倍增时间的测定按生长曲线计算细胞的倍增时间。取细胞峰值前一天的细胞计数（丫）、接种细胞数（X）及生长时间（T） 计算。倍增时间=T/AA=log2Y/X细胞的倍增时间应不超过20小时。（3）克隆率的测定 按有限稀释法将细胞稀释至每 1ml含10 个活细胞的浓度，按每孔1个细胞接种于96孔细胞培养板，每板至 少接种60孔，于37C、5%二氧化碳培养，定期观察细胞克隆生长情 况，培养1周后计数每孔中的细胞克隆数，并计算克隆率，应不低于 70%。克隆率=A/BX100

4、%式中 A为细胞克隆数；B为接种细胞的总孔数。无菌检查 依法检查（通则1101）,应符合规定。支原体检查 依法检查（通则3301）,应符合规定。大肠杆菌噬菌体 采用噬斑法和增殖法检测。不得有噬菌体污染。病毒检查细胞培养法及荧光抗体检测（1）样品制备 取约250ml的新生牛血清供试品用于检测，将 其配制成含15%供试品的培养液，用于检测全过程的细胞换液及传代。以检测合格的血清作为阴性对照血清。（2）指示细胞制备 至少采用猴源（如Vero细胞）、2种牛源细 胞（BT和MDBK细胞或无病毒污染的原代牛肾细胞） 以及人二倍体 细胞作为指示细胞。细胞复苏后至少传代1次后使用。根据所需量制 备足够量的细胞

5、。（3）用含有供试品的培养液将4种指示细胞分别接种于75cm2 细胞培养瓶中，接种量应使细胞在培养7天后可达到至少80%90% 汇合。同时制备阴性对照血清培养瓶。将培养瓶置 37C、5%CO2培 养箱中培养至少7天。可在第5天时换液一次。（4）第7天进行第1次盲传，将接种供试品及阴性对照的每种 指示细胞培养瓶分别传出至少 2个75cm2培养瓶，继续培养至第14 天，在第12天时可换液一次。（5）在第13天时（或第2次传代前1天）或阴性对照瓶细胞达 到至少70%汇合时，制备阳性对照用细胞。即取1个阴性对照细胞瓶 分别传至6孔板或其他适宜的细胞板中用于细胞病变观察（CPE）、 血吸附检查（HAd

6、）及荧光抗体检测（IF）,次日接种阳性对照病毒。（6）第14天时进行第2次盲传。将第1次传代后的细胞培养物 分别传至6孔板或其他适宜的细胞板中，进行细胞病变观察及HAd检查时，接种于每种指示细胞上的待测样本至少接种 3孔；进行荧光 抗体检测时，接种于每种指示细胞上的待测样本进行每种病毒检测时 至少接种2孔。继续培养至少至第21天。剩余细胞样本-60C或以下 保存备用（7）在第14天接种阳性对照病毒：取（5）制备的指示细胞接 种适量阳性对照病毒，置 36C4C、5%CO2培养箱吸附2小时，吸 弃上清液，加入适量细胞维持液，置 36CC、5%CO2培养箱培养 7天。对于BT细胞，BVDV可作为病变

7、阳性对照，BPI3可作为HAd 阳性对照，牛副流感病毒3型（PI3）、牛胰病毒（BAV-3）、牛细小病 毒（BPV）以及牛腹泻病毒（BVDV）可作为IF检测阳性对照；对 于MDBK细胞，呼肠孤病毒3型（REO3）和PI3可分别作为细胞病 变及HAd检查阳性对照，PI3、BAV-3、BVDV、REO-3为IF检测阳 性对照；对于Vero细胞，PI3可作为细胞病变及HAd检查阳性对照， PI3及REO-3作为IF检测阳性对照。可不设立狂犬病病毒（Rabies） 阳性对照。所有IF检测阳性对照病毒应接种100300CCID50。（8）接种阴性对照及供试品的细胞培养物在接种后每日观察细 胞病变情况，在

8、接种后至少21天或末次传代后至少7天时分别进行 病变观察、HAd检查及IF检测。阳性对照培养物在接种后第 7天或 10%细胞出现CPE时可进行IF检测。进行血吸附检查时，用鸡与豚鼠血红细胞在 28c及2025c 进行检测。进行荧光抗体检测时，将细胞固定后采用直接或间接免疫荧光抗 体检查法，至少应对 BVDV、PI3、BAV-3、BPV、REO3以及Rabies 进行检查，结果均应为阴性。（9）结果判定 阴性对照应无细胞病变，血吸附检查应为阴性， 荧光抗体检测应为阴性；阳性对照应有明显的细胞病变，血吸附检查 应为阳性，荧光抗体检测应为阳性，判为试验成立。供试品如无细胞 病变，血吸附检查为阴性，且荧光抗体检测为阴性，判定为符合要求。 待测样本如出现细胞病变，或血吸附检查为阳性，或任何一种荧光抗 体为阳性，则判定为不符合要求。经病毒灭活处理的牛血清，灭活前取样检测后若任何一项检测显 示为阳性，不建议用于生产。除非可鉴别出污染的病毒，且病毒灭活 工艺验证研究显示其污染量可被有效灭活时方可使用。如果灭活前 BVDV病毒检测为阳性，灭