脲酶米氏常数简易测定

1、生物技术专业系统实验（四） 酶（蛋白质）工程实验VI1六、脲酶米氏常数（Km值）简易测定 21.目的意义 2.实验原理3.仪器设备 4.实验方法5.实验报告 6.思考题31.目的意义 1913年，由Michaelis L.和Menten M.在前人研究的基础上提出的米氏方程（Michaelis-Menten Equation）是酶学中表示一个酶促反应的起始速度V与底物浓度S关系的方程。 1925年，经过Briggs和Haldane修正后，提出更有普遍意义的酶促反应速度方程，如下所示：、4其中，V为酶促反应速度；Vmax为最大反应反应速度（与V的单位相同, molL-1min-1）； S为底物浓

2、度（molL-1）；Km为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度,即V = 1/2Vmax时, Km = S 。在酶促反应中，底物在低浓度情况下，反应相对于底物是一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度S逐渐增大时，速度V相对于S的曲线为一双曲线。下图为米氏方程的模拟作图： 5米氏常数的意义由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时,即V = 1/2

3、Vmax时, Km = S 。 上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。因此,米氏常数的单位为molL-1。不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。通过Km值的测定，可鉴定酶的各种底物，Km值最小者为酶最佳底物，即天然底物。62.实验原理底物浓度对酶促反应的影响在酶浓度、pH、温度等条件不变的情况下研究底物浓度和反应速度的关系。如右图所示：在低底物浓

4、度时, 反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。7 酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测定有多种方法。比如固定反应中的酶浓度，然后测试几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得Km和Vmax值。但直接从起始速度对底物浓度的图中确定Km或Vmax值是很困难的，因为曲线接近Vmax时是个渐进过程。因此，通常情况下，我们都是通过米氏方程的双倒数形式来测定，即Lineweaver-Burk plot，也可称为双倒数方程(double-reciprocal plo

5、t)：8 用1/V 对1/S作图，即可得到一条直线，该直线在Y轴的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为1/Km的绝对值，斜率为Km/Vmax。如图所示：Km=-1/x93.仪器设备3.1 试剂大豆粉（教师准备）。脲酶液：取大豆粉2g移入250ml三角烧瓶，加30%酒精100ml，连续搅动15min，室温下静止1-4h，离心或脱脂棉过滤，收上清备用（上清液需清亮、透明）。30%酒精（教师准备） 。0.1 molL-1脲液：取尿素0.6g定容至100ml。然后分别稀释至1/20、1/30、1/40、1/50 molL-1系列液（教师准备） 。1/15 molL-1PB（磷酸盐缓冲液，pH7.0

6、；教师准备）。100gL-1硫酸锌（教师准备） 。100gL-1酒石酸钾钠（教师准备） 。10纳氏试剂： 分别溶解3.5g氯化高汞（HgCl2）于20ml热蒸馏水，10g碘化钾于5ml水中，再将前者慢慢倒入碘化钾溶液中，不断搅拌，直至出现微红色的少量沉淀为止。向此液中加70ml 30%KOH，不断搅拌，再滴HgCl2溶液至出现红色沉淀为止。混匀，静置过夜。倾出上清液贮存于棕色试剂瓶（用橡皮塞）中放置暗处保存。显色液： 将100gL-1酒石酸钾钠和纳氏试剂按1：2混合即成显色液（临用前混合）113.2 器材15ml 大试管20支1ml 移液管2支5ml 移液管2支10ml 移液管2支200ml

7、烧杯2个100ml 烧杯2个玻棒 1支双蒸水1瓶（50ml）比色皿1套（4个）、玻璃皿1套、洗瓶1个吸耳球 1个恒温水浴锅1台试管架2个200l-1000l、20l-200l、0.5l-10l移液器各1支；小号、中号、大号枪头各1盒（需灭菌）旋涡混合器1套（置于每组桌上）124.实验方法取一定量的酶（稀释为10-5倍）；加入各种不同浓度的底物（如表所示）；在一定时间内测定产物的量（15min）；建立x，y轴，作图，建立回归方程；在Y=1/2Vmax时，求其x（即S）Km；134.1 测定取5支试管，分别标记1-5号，按照下表操作。迅速摇匀，用分光光度计在420nm下测定各管A值。144.2 数据处理各管在420nm测定OD420nm值。由于光密度（OD420nm）与显色，显色与底物浓度成正比，反应时间均为15min。故以1/A取代1/V为纵坐标作图。测定所用单位为Km单位gL-1 。由1/A对1/S作图，求得回归方程，计算-淀粉酶催化可溶性淀粉溶解的米氏常数Km。155.实验报告5.1 根据所得数据填写实验报