PRRS实验室诊断监测课件

1、PRRS实验室诊断监测技术 -RT-PCR检测技术 黑龙江省动物卫生监督所第1页，共32页。主 要 内 容PCR 技术PRRSV RT-PCR 检测技术第2页，共32页。动物病毒的组成两部分1. 蛋白质：HA、HI、ELISA2. 核酸：分为两种 脱氧核糖核酸（DNA）-PCR 核糖核酸（RNA）-RT-PCR 第3页，共32页。PRRS病毒粒子的结构第4页，共32页。PCR 技术第5页，共32页。概念 PCR是一种在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，它以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸引物介导，通过DNA聚合酶酶促反应，快速体外扩增特异DNA序列。 第6页，共32

2、页。PCR技术简史1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段所以，Khorana的设想被人们遗忘了PCR的最初设想PCR的实现PCR的改进与完善第7页，共32页。PCR技术简史 PCR的最初设想PCR的实现PCR的改进与完善1985年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用大肠杆菌DNA聚合酶进行PCR，其

3、缺点是：Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加。引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。 第8页，共32页。PCR技术简史1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：耐高温，在70下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(

4、2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。 PCR的最初设想 PCR的实现 PCR的改进与完善第9页，共32页。基本原理适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。第10页，共32页。1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变

5、性形成2条单链子链延伸DNA加倍第11页，共32页。PCR反应条件1）PCR反应成分（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶，特别是染色体中的组蛋白、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。第12页，共32页。（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。（3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 l 酶量过高可引起反应非特异性扩增;酶量过少则合成产物量减少。第13页，共32页。（4）dNTP dNTP浓度取决于

6、扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等，如果有一种浓度不同于其他几种，就会引起错配。 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。第14页，共32页。（5） Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高反应特异性降低，出现非特异扩增。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。第15页，共32页。2）循环参数变性 一般情况下，9394lmin足以使模

7、板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。(2) 退火 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm值-(510)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。 第16页，共32页。3）延伸 PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用 温度

8、为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR 延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加第17页，共32页。PCR的特点特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：引物与模板DNA特异正确的结合； 碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个PFU细

9、菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，24 小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA第18页，共32页。PCR的应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，基因诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测第19页，共32页。PRRSV RT-PCR 检测技术第20页，共32页。用途猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测试剂盒，用于检测猪血清和组织中的PRRSV，适用于PRRSV 的检测、诊断和流行病学调查

10、。第21页，共32页。原理利用离心柱内硅基质膜提取 RNA，在反转录酶的作用下，以RNA 为模板，以引物为起点合成与RNA 模板互补的cDNA 链。在TaqDNA 聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火、中温延伸的循环，使特异DNA 片段的拷贝数放大一倍。经过35 次循环，最终使扩增DNA 片段放大了数百万倍。将扩增DNA 片段进行电泳，经染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见到DNA 片段的扩增带。第22页，共32页。反转录单管一步法反转录和PCR反应在一个管子中完成，得到的全部cDNA产物都一起经PCR扩增，灵敏度更高，但是容易相互干扰。两步法反转录和PCR分开做，PCR取反转录反应产物的1/10

11、进行，更为灵活和严谨，但是灵敏度不如前者高。第23页，共32页。第24页，共32页。自备的器材仪器：分析天平、离心机、PCR 扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、微波炉、组织研磨器、-20 冰箱、可调移液器（2 L、20 L、200 L、1000 L）。第25页，共32页。样品的制备1 样品采集：病死或扑杀的猪，取肺、扁桃体和脑等组织；待检活猪，用注射器取血5 mL。28 保存，送实验室检测。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融病料。）2 样品处理：每份样品分别处理。第26页，共32页。2.1 组织样品处理：称取猪组织0.05 g 于研磨器中研磨，加入1.5 mL 生理盐水继续

12、研磨，待匀浆后转至1.5 mL 灭菌离心管中，8000 rpm 离心2 min，取上清液100 L 于1.5 mL 灭菌离心管中。2.2 全血样品处理：待血凝后取血清100 L，置1.5 mL 灭菌离心管中。2.3 阳性对照处理：取阳性对照100 L，置1.5 mL 灭菌离心管中。2.4 阴性对照处理：取阴性对照100 L，置1.5 mL 灭菌离心管中。第27页，共32页。操作步骤1 病毒RNA 的提取1.1 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600 L，充分颠倒混匀，室温静置35min。1.2 将液体吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时

13、堵塞吸附柱），13000 rpm 离心30 s，弃去收集管中液体，套上收集管。1.3 向吸附柱中加入600 L 洗液，13000 rpm 离心30 s，弃去收集管中液体，套上收集管。1.4 重复步骤1.3。1.5 再空柱13000 rpm 离心2 min。1.6 将吸附柱移入新的1.5 mL 离心管中，在膜中央加入洗脱液25 L，室温静置1 min，13000 rpm 离心30 s，获得总RNA。第28页，共32页。2 RT-PCR 操作程序每份总体积 20 L，含16.8 L RT-PCR 反应液（用前混匀），1.2 L 酶混合液，2 L 模板RNA。例如：n 份样品（n10），配制n+1

14、份，16.8（n+1）RT-PCR 反应液，再加入1.2（n+1）酶混合液混匀，取18 L 分装成n 份，分别加入2 L 模板RNA，加入矿物油20 L 覆盖（有热盖的PCR扩增仪不用加矿物油），作好标记。在 PCR 扩增仪上进行以下程序：42 45 min，94 3 min；扩增条件为94 30 s，55 30 s，72 30 s，35 个循环；72 延伸7 min。第29页，共32页。3.电泳称 3 g 琼脂糖放于500 mL 锥形瓶中，加入50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液200 mL（取4 mL 50 倍TAE 电泳缓冲液，用双蒸水稀释至200 mL），于微波炉中熔解，再加入10 L 染色液混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR 扩增产物10 L 点样于琼脂糖凝胶孔中，以110120V电压于50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。第30页，共32页。结果判定阳性对照出现436 bp 扩增带、阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品出现436 bp 扩增带为猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性，否则为阴性。第31页，共32页。注意事项1所有接触病料的物品均应合理处理，以免污染实验室。2PCR 整个试验分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。流