不同血液保存方法对RNA提取的影响(简易版)

1、不同血液保存方法对 RNA1取的影响一、引言探索血液 RNA 保存方法的必要性全血作为较易获取的人体标本，特别适用于实验室和临床检测。高质量的RNA可以满足 RT-PCR qRT-PCR Northern blot、基因表达谱、转录组测序、核酸酶保护实验和阵列分析等生物学下游实验的研究需求1 。但由于 RNA 自身结构为单链状态，极不稳定，同时广泛分布的RNase 时刻发挥着降解RNA 的功能，其活性难以被抑制，因此使得从全血中提取RNA 以及对 RNA 的保存相对困难。常见的血液RNA 保存方法第一种为分离白膜层2，加入RNAlater 保护剂冻存-80 。此种方法为目前样本库常用的血液RN

2、A 保存方法，采血后需在常温保存 4 小时内完成白膜层分离，或在采血2 小时内放入4 冰箱保存，24 小时内 4 低温分离，将分离获得的白膜层用 RNAlater 保护剂保存， RNAlater 的主要作用为提供高盐环境使细胞脱水，抑制核酸酶活性。此种方法的优势在于可将全血中大部分对于提取RNA无用的成分去除，缩减了样本的体积，更加便于保存。但此种方法的弊端在于，首先分离白膜层的过程较为繁琐，需要多次离心，在临床医院或临时的采血点往往难以实施，其次高盐脱水后的细胞复性困难，提取RNA 的难度增加，且高盐组分不易去除，提取的 RNA 纯度不高，最后血液在分离白膜层过程中，会有部分白细胞及RNA

3、组分缺失。第二种为专用的静脉真空采血管，其中添加了特殊的试剂，可以保护细胞内的 RNA ，防止降解，但此方法核酸得率偏低，需大量血液来支撑下游实验研究。本实验内容纵向地比较了两种血液保存方式下， RNA 保存效果的对比；并探索了在不同保存温度及不同保存时间下， RNA 的保存效果。希望本文可为广大的科研同胞们提供帮助。二、材料和方法标本来源本组血液样品均采自同一志愿者，采用标准静脉穿刺技术，一次性使用真空 采血管EDTA Na2 5 ml （购于江苏康捷医疗器械有限公司）采集静脉血，全部标 本白细胞计数范围为3.16 1033.25 103。方法白膜层分离采集3管新鲜血液，每管5ml,采血后1

4、0 min内3,000 rpm离心10min,吸 弃血浆，加入和血浆等体积的 PBS缓冲液，颠倒混匀。取15 ml离心管，加入 7.5 ml Ficoll-paqueTM PLUS lymphocyte isolation sterile solution （购于 GE 公司， Lot.10244745）,吸取采血管中血细月fi加入分离液中分层，2,000 rpm离心20min。 吸弃上层PBS,移液器吸取白膜层转移至5 ml离心管中，加入PBS吹打混匀， 2,000 rpm离心10min,弃上清。加入400 l PBS缓冲液重悬，然后分别缓慢加 入不同RNA保护液。Q 组：力口入 1.2 m

5、l RNAlater RNA Stabilization Reagent （购于 Qi*n 公司， Lot.15*995 ）;A 组：加入 1.2 ml A*on RNAlater Solution （购于英 * 基，Lot.00*70 ）； B 组：加入 1.2 ml RNAfixer 保存液（购于 Bioteke 公司,Cat. RP1302）。将三管样品均冻存于-80C保存。白膜层RNA提取（沉淀法）取200 l保存的白膜层，加2 ml RL裂解液，涡旋混匀30 s,室温裂解15min； 加入300 l氯仿，涡旋混匀10s,室温放置3 min； 12,000 rpm离心10min,吸 取

6、水相，加入等体积异丙醇，-20C沉淀至少2h,若出现浑浊，加入DEPC水配 制的50%异丙醇，直至混浊消失；4C, 12,000 rpm离心15min,小心弃上清； 加入1 ml 75%乙醇漂洗2次；30 l RNase-free H2O溶解。白膜层RNA提取（离心柱法）严格按照试剂盒操作说明操作，所用试剂盒为：血液（液体样本）总 RNA快速提取试剂盒（离心柱型）（购于 BioTeke,Cat.RP4001);动物组织总RNA提取试剂盒（离心柱型）（购于Tiangen, Lot.P4920）。血液RNA保存管提取RNA采集新鲜全血，30 min内转移2.5 ml至10 ml血液RNA保存管（购

7、于 BioTeke, Cat. ST1001）中，涡旋混匀30s,室温放置10 min,而后转移至不同 条件保存。提取时取1.6 ml液体，恢复室温，放置10分钟，加入200 l氯仿， 涡旋混匀10s,室温放置3 min； 4 C 12,000 rpm离心10min,吸取水相，加入 等体积70%乙醇，混匀，将混合液加入 RA柱，12,000 rpm离心1 min,弃滤液； 加入500 l去蛋白液RE, 4 C 12,000 rpm离心1 min,弃滤液；加入700 l漂 洗液RW,4c 12,000 rpm离心1 min,弃滤液；力口入500 l漂洗液RW,4c 12,000 rpm离心1 m

8、in,弃滤液；4C 12,000 rpm离心2 min；将吸附柱RA插入新的1.5 ml 离心管，加入 30 l RNase-free H2O 溶解 3 min； 12,000 rpm 离心 1min。RNA质量检测采用超微量紫外分光光度计测定紫外 260nm处吸光度值计算RNA浓度， A260/A280和A260/230比值判断提取纯度。电泳时取5 l核酸，采用UltraPower 核酸染料点染，2%琼脂糖凝胶，150V电压条件下电泳15min拍照，曝光时间 2s。三、结果与分析分离白膜层法RNA保存结果与分析表1.沉淀法提取RNAlater保存的白膜层RNA浓度结果Abs260Abs280

9、Abs230260/230260/280样品浓度 样品类型样品编号(ng/l)B0.3750.2251.7450.211.6715.0RNAQ0.2770.1731.0770.261.611.1RNAA0.6260.4162.4150.261.5125.0RNA表2. BioTeke离心柱法提取RNAlater保存的白膜层RNA浓度结果组别Abs260Abs280Abs230260/230样品浓度260/280(ng/ l)样品类型B0.3640.2080.9250.391.7514.5RNAQ0.3120.1640.2681.171.912.5RNAA0.350.1940.4460.781.

10、8114.0RNA表3.Tiagen离心柱法提取RNAlater保存的白膜层RNA浓度结果Abs260Abs280Abs230260/230260/280样品浓度 样品类型样品编号(ng/l)B0.2720.1510.5950.461.810.9RNAQ0.3290.1664.3390.081.9813.2RNAA0.2920.1470.9170.321.9911.7RNA分析：全血经分离白膜层后，采用 BioTeke、Q及A三家品牌的RNAlater 保存液保存后，分别采用了沉淀法及离心柱法（两种品牌）提取 RNA,均未能 成功提取RNA。表现在两方面，一是 OD260/230比值严重偏低，

11、说明其中有大 量盐分的残留，二是得率极低，三种方法的平均得率依次为1.02 g/ml、0.82 g/ml 及0.72 g/ml （表13）。因此，全血经分离白膜层后，RNA提取效果不好。保存管法（Bioteke） RNA保存结果与分析表4.血液RNA保存管在不同温度下保存3天后提取结果编号保存温度Abs260Abs280Abs230260/230260/280样品浓度样品旧(ng/ l)125 C2.6761.3673.5510.751.96107.0RNA225 C3.3581.7883.1161.081.88134.3RNA34C2.9521.5923.210.921.85118.1RNA

12、44C2.811.3981.7181.642.01112.4RNA5-20 C3.7512.0013.3431.121.87150.0RNA6-20 C3.0291.5832.5641.181.91121.1RNA78-80 C-80 C2.6643:7661.2932.0681.22744552.17052.06182106.61506RNARNA12345678iss *图1.血液RNA保存管在不同温度下保存3天后提取结果电泳图表5.血液RNA保存管在不同温度下保存7天后提取结果编保存Abs260Abs280Abs230260/230260/280样品浓度样品号温度(ng/ l)回125

13、C3.9892.0712.0521.941.93159.6RNA225 C2.8551.4211.4421.982.01114.2RNA34 c2.9621.5041.8771.581.97118.5RNA44 c3.0481.5441.6351.861.97121.9RNA5-20 C2.4211.2171.5421.571.9996.8RNA6-20 C2.3131.1571.2881.8292.5RNA7-80 C2.7551.4682 8250 981 881102RNA8-80 C3.0091.5532.6921.121.94120.4RNA1 2 3 4 5 6 782SS1SS

14、图2.血液RNA保存管在不同温度下保存7天后提取结果电泳图表6.血液RNA保存管在不同温度下保存一年后提取结果编县保存260/230样品浓度汨即Abs260Abs280Abs230260/280(ng/ D样品类型5-20 C3.0441.5832.3471.31.92121.8RNA6-20 C2.8891.4661.7891.611.97115.5RNA78-80 C-80C2.739-376641.4181.9431.8413:271.49-1121.93-19109.6146BRNARNA567828S 18S 图3.血液RNA保存管在不同温度下保存一年后提取结果电泳图分析：样本经Bi

15、oteke血液RNA保存管保存3天时，25 C、4 C、-20 C 和-80 C保存条件下的RNA得率无明显的差异，平均为8.75 g/ml;保存7天的 结果RNA平均得率为9.82 g/ml, 25 C的血液开始降解；-20 C- -80 C保存1 年血液RNA无明显降解（表46,图13）。因此，全血经Bioteke血液RNA保 存管保存后，效果优。四、讨论血液中核酸绝大部分存在于白细胞当中，而白细胞仅占血液成分1%左右，并且血液中含有丰富的 RNA 酶，这就使得血液的保存以及RNA 提取变得十分棘手。通过本文实验，采用淋巴细胞分离液分离白膜层后，提取RNA 效果较差。分析原因可能是RNAlater 本身为高盐溶液，其本身会造成白细胞失水皱缩，导致复性困难。采用 Bioteke 血液 RNA 保存管保存血液，其3 天、7 天、 1 年的平均得率为9.33ug/ml ， Bioteke 核酸得率约为市面上常用的 D 公司 Blood RNA Tube 采血 管的 7.8倍。此外全血采集后直接冻存-80 也可作为一种保存血液的方式，已有研究表明，尽管低温可以抑制酶的活性，但即使在-20 C甚至-80 C中，RNase还可以缓慢发挥功能， -80 保存一周的 RNA 浓度和纯度与新鲜全血