光谱技术课程设计

1、摘要物质中的原子和分子处于不停的运动状态之中，这种物质内部的运动，在外部 以辐射或吸收的形式表现出来，这种形式就是电磁辐射。按照波长顺序排列的 电磁辐射时光光谱。由于原子、分子的运动是多种多样的，因此光谱的表现形 式也是多种多样的。依辐射能传递情况划分：发射光谱、吸收光谱、荧光光谱(发光光谱) 腐殖质的荧光特性被广泛用来解析其在各种天然环境中的来源及分布。由于荧 光光谱分析具有灵敏度高，选择性好，且不破坏样品结构的优点，非常适合用 来研究腐殖质的结构和官能团等特征。利用三维荧光激发-发射光谱研究了 Fluka腐殖酸的荧光光谱特性，结果显示，离子强度(0-0.05mol/L KCLO4)对 Fl

2、uka腐殖酸的三维荧光光谱特性影响非常小，而腐殖酸的浓度(5-100mg/L) 和溶液PH(2-12)对其三维荧光光谱特性影响显著。当腐殖酸浓度增大时，荧光 峰出现明显红移现象。荧光强度一般随着PH的升高而增大，当PH大于10后呈 下降趋势，我们从垃圾渗滤液溶解有机质的实验结果中也得到相同结论；在浓 度为50mg/L和100mg/L的Fluka腐殖酸中，荧光峰B(fu lvie-like)的荧光强 度却在PH=5.0左右时达到最大值，与前人报道的土壤富里酸的行为一致，质子 化常数lgK m分别为3.57和3.13，与二羧基化合物接近，说明荧光峰B可能 与Fluka腐殖酸结构中的羧基有关；荧光峰

3、A与荧光峰B的荧光强度比值 r(A/B)在0.61-2.59之间，并且在PH=2-11范围内，r(A/B)与PH具有较好的线 性相关关系，表明荧光峰A和荧光峰B随着PH值的改变有着相同的变化趋势。1关键词：Fluka腐殖酸；溶解有机质；三维荧光光谱；荧光特性目录 TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark10 o Current Document 引言2 HYPERLINK l bookmark13 o Current Document 理论基础2常用的荧光光谱有激发光谱，发射谱。2光源：能发生光学光谱区电磁辐射的物质体系都可称为光源2影响荧光光谱荧光强度的因素3 H

4、YPERLINK l bookmark26 o Current Document 实验方法4方法4分析5 HYPERLINK l bookmark29 o Current Document 预期结果9 HYPERLINK l bookmark32 o Current Document 参考文献10引言腐殖质作为自然界中最丰富的有机质，普遍存在于土壤、水体（如湖泊、河流、 海洋和地下水等）以及沉积物中。在水环境中，腐殖质是溶解有机质的主要组 分。由于腐殖质所带的配位基团能够强烈络合金属离子，对有毒重金属元素的 浓度、化学形态和生物有效性、以及营养元素的循环过程起着极其重要的作用， 并且腐殖质还能

5、通过其官能团键合离子性或极性有机化合物、通过分子间的范 德华力与疏水有机物结合，所以对腐殖质结构和官能团特征的研究显得非常重 要。这些研究有助于我们更好地了解它们与重金属离子、放射性核素之间的配 位作用、氧化还原作用、沉降作用等内在机理，以及对污染金属离子、营养元 素和有机污染物的地球化学行为的影响1。随着分析化学的进展，尤其是核磁共振、红外光谱、固定金属离子亲合色 谱 和高效体积 排阻色 谱等仪器分析方法及手段的发展，人们对腐殖质的 化学结构以及各种环境行为有了更多的了解。而应用荧光光谱技术研究腐殖质 是基于其结构中含有大量带有各种官能团的芳香环结构以及未饱和脂肪链（物 质之所以具有荧光是由

6、于其结构中具有低能量跃迁的芳香结构或共轭生色团）。 并且由于荧光光谱技术具有灵敏度高（10的-9数量级），选择性好，且不破 坏样品结构的优点，非常适合用来研究腐殖质的化学和物理性质。目前各种荧 光光谱技术如荧光激发光谱、荧光发射光谱、同步荧光光谱以及三维荧光光谱% 亦称总发光光谱或激发,发射矩阵图被广泛用于定性或定量描述腐殖质的物理化 学特性。腐殖质内含有几种不同的荧光基团，其荧光特性包含了与结构、官能团、构型、 非均质地球化学性、分子内与分子间的动力学特征等有关的信息。3DEEM能够 获得激发波长和发射波长同时变化时的荧光强度信息，并且可对多组分复杂体 系中荧光光谱（激发/发射，Ex/Em）

7、重叠的对象进行光谱识别和表征，是一种 很有用的光谱指纹技术2。本文拟通过研究Fluka腐殖酸（Fluka HA）的3DEEM特性及其与浓度、离子强度、 PH值之间的关系，为准确描述腐殖质这一自然界最为复杂的天然有机物提供有 用的结构和官能团特征。本文主要进行PH值、离子强度和腐殖酸浓度效应的研 究。理论基础常用的荧光光谱有激发光谱，发射谱。激发光谱：固定测量波长（选最大发射波长），化合物发射的荧光强度与激发 光波波长的关系曲线（激发光谱曲线的最高处，激发态的分子最多，荧光强最 大）发射光谱：固定激发波长，发射强度与发射波长的关系。光源：能发生光学光谱区电磁辐射的物质体系都可称为光源光源按谱线形

8、状可分为连续光源和线光源，线光源用于荧光、原子吸收和 Raman光谱法。本文选用的光源为激发光源。影响荧光光谱荧光强度的因素（1）溶剂的影响同一物质在不同溶剂中，其荧光光谱的形状和强度都有差别。一般情况，荧光波长随着溶剂机型的增大而长移，荧光强度也有所增强。溶剂粘度减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增加而荧光减弱。故荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。由于温度对溶剂的粘度有影响，一般是 温度上升，溶剂粘度变小，因此温度上升，荧光强度下降。（2）温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加快，分子间碰撞的几率 增加，外转换去活的几率增加，荧光效率降低。（3）溶液pH对酸碱化合

9、物，溶液pH的影响较大，需要严格控制当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的荧光强度有影响 这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，离子结构发生变化，因 此荧光强度也有差异。每一种荧光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式， 也就是有它最适宜的pH值范围。（4）内滤光作用和自吸现象内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光；自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠， 产生自吸收；如蒽化合物。3实验设计3实验方法1.方法本实验所用腐殖酸为Fluka humic acid,样品在使用前未加提纯（因为提纯过 程会影响其固有的荧光特性），使用

10、0.01mol/L KOH溶解，再用CF/F玻璃纤维 滤膜（预先于450摄氏度灼烧5min）过滤后测定荧光强度。所用化学试剂均为 优级纯或分析纯。配制溶剂等所有实验用水均为Milli-Q超纯水 （Millipore）2。浓度及PH值效应：配制4种浓度（5mg/L,10mg/L,50mg/L和100mg/L）的 Fluka HA溶液（离子强度0.01mol/L KCLO4），分别测定PH=2-12之间（间隔为1） 的 3DEEMs。离子强度效应：配制浓度为50mg/L的Fluka HA溶液（离子强度分别为 0mol/L,0.005mol/L,0.01mol/L 和 0.05mol/L），测定其在

11、 PH 约为 2,5,8 和 11 时的 3DEEMs。样品 PH 值均使用 0.1mol/L,1.0mol/L KOH 和 0.1mol/L,1.0mol/L HCLO4溶液，并采用10uL色谱进样器（最小刻度0.2uL）调节。PH从2调节到12 左右，总共在20mL HA溶液中加入酸碱的量不超过100uL,以便减小浓度稀释 效应。使用奥立龙818型PH计（每次使用前均用PH=4.00,6.86和9.18标准缓 冲溶液进行两点校正）测定PH值。3DEEM测定在Hitachi F-4500型荧光光谱分析仪上完成。使用150-W氙弧灯为 激发光源，PMT电压：700V；带通：Ex=5nm,Em=

12、10nm；扫描波长范围:Ex=280- 480nm,Em=370-570nm ；响应时间：自动；扫描速度：1200nm/min ；扫描光谱进 行仪器自动校正。样品在装入1cm石英荧光样品池测定前保持温度恒定恒温水 浴20摄氏度上下1摄氏度变化范围内使用SigmaPlot软件进行3DEEM数据处 理。2.分析最早，土壤学家应用传统荧光光谱技术区分不同来源腐殖酸，但腐殖酸的荧光 激发或发射光谱通常表现为宽而无特征的荧光峰。近十几年来，海洋化学家首 先应用3DEEM分析海洋溶解有机质的组成，发现其中含有几种不同荧光基团。 另外，人们对河流、湖泊、湿地及沼泽中的溶解有机质，土壤腐殖质，洞穴滴 水、珊瑚

13、礁中有机质等的研究表明，不同来源的溶解有机质或腐殖质具有不同 的荧光基团，并且荧光峰的位置和荧光强度也不尽相同2。一般而言，天然环境中各种溶解有机质的Ex/Em荧光峰位置可概述如下：Class 1（Ex 约为 310-440nm,Em 约为 430-510nm）； Class 2（Ex 约为 310-360nm,Em 约为 370-450nm） ； Class 3（Ex 约为 260-290nm,Em 约为 300-350nm） ； Class 4（Ex约为240-270nm,Em约为370-440nm）。其中Class 1为类腐殖酸荧光 （humic-like），Class 2与Class

14、4为类富里酸荧光（分别称为visible fulvic-like and UV fulvic-like）,Class 3 为类蛋白荧光（protein-like）。 由于微生物来源的DOM具有强烈的类蛋白荧光，而陆源腐殖酸的荧光峰主要出 现在Class 1和Class 2位置，这样我们就可利用3DEEM区分DOM的来源及组 成1。本文对Fluka HA的3DEEM表征主要基于等高线图、荧光峰数目、Ex/Em峰位置 及荧光强度、Class 1与Class 2荧光峰的荧光强度比值r（A/B）等。2.1 Mobed et al 报道，水体富里酸（fulvic acid;FA）浓度在 5mol/L,5

15、0mol/L 和100mg/L时（离子强度0.01mol/L KCL）的荧光特性并没有显著差别，认为这 种现象可能是由于相对较低的离子强度所造成，也可能是不同来源的腐殖质对 于腐殖质分子之间的聚集作用表现出不同的光谱效应。之前Lochmulle et al 发现商品富里酸在高浓度时可能发生聚集作用使光谱特性发生改变。为了充分检验Fluka HA的荧光光谱特性与浓度之间的关系，我们配制4种浓度 （5mg/L,10mg/L,50mg/L和100mg/L）的腐殖酸溶液，PH分别为6.0和10，离子 强度均为0.01mol/L KCLO4（图1）。当腐殖酸浓度为5mg/L时，最大的Ex/Em都 出现在

16、310/415nm。随着腐殖酸浓度增大，最大Ex/Em峰位置红移至460/540。进一步分析这些谱图可以发现，其实每个谱 图都有一些肩峰 存在。不难理解， 肩峰是由于腐殖酸分子中含有多种荧光基团造成的。腐殖酸浓度发生变化时，将 导致腐殖质的荧光内滤效应，荧光猝灭及能量转换等过程的差异，在三维荧光 光谱图上就表现为Ex/Em值峰的红移或蓝移现象。从图1还可以看出，同一浓 度腐殖酸在PH=10时比PH=6.0时的Ex/Em值略微红移。腐殖酸浓度为10mg/L 时，碱性条件下明显出现Ex/Em=460/550nm荧光峰，而在酸性条件下时不明显。罔 I ：himnt Huh, HAIijt 引;或hu

17、Mi艮 耳ija diff-iFiilill = 6.a tLiid JO1； OlO mnl / I. KG1h.22.2本实验中，离子强度范围在0 0.05mol/L KCLO4之间,PH值分别为 2.0,5.0,8.0,和11时，离子强度对Fluka HA的3DEEM影响并不大（见图2）。 从图2我们还发现，当PH=2，离子强度为0mol/L KCLO4时Ex/Em=325/450nm，22.3溶液PH值对腐殖酸荧光特性的影响研究表明，溶解有机质（包括腐殖质）的荧光强度随着PH值升高而增大。荧 光光谱的这种变化与有机大分子结构中的酸性基团（如苯酚基团）以及自身的分 子构型随着PH的改变有

18、关。酚羟基浓度越高，PH值对荧光强度的影响越大1。 图3显示，当Fluka HA浓度为5mg/L和10mol/L等低浓度时，PH值的变化没 有引起Ex/Em峰位置的显著改变，只是荧光强度随着PH值的升高而增大（图 4a），当PH10时，浓度为5mg/L的Fluka HA荧光强度随之下降，而浓度为 10mg/L的Fluka HA荧光强度变化不大。从整个PH范围来看，低浓度腐殖酸的 荧光强度在PH=4-10区间内保持相对稳定。前人对湖泊DOM（图4c）、海洋DOM、 标准腐殖质、珊瑚有机质和的研究也得到类似的实验结果。我们使用垃圾渗滤 液DOM研究其荧光强度与PH值关系时，也可以看到荧光强度随着P

19、H升高而逐 渐增大，到PH10以后又呈下降趋势（图4c），只是垃圾渗滤液中DOC含量很 高（为85.5mg/L），稀释5倍后其荧光强度依旧达到河流或湖泊溶解有机质荧 光强度的10倍以上（图4c）。当Fluka HA浓度为50mg/L（图2），PH=2.0时只有一个明显的荧光峰，其 Ex/Em=330/450nm。随着PH值升高，逐渐出现三个明显的荧光峰： Ex/Em=470/540nm,370/470nm 和 290/500nm。而且不难发现，Ex/Em=470/500nm 的峰位置随着PH值升高发生明显红移。当Fluka HA浓度为100mg/L时，在 PH=2.0-10范围内，只出现一个明

20、显的荧光峰。随着PH值升高，其荧光峰位置 逐渐红移。前人在对IHSS标准腐殖质的研究中也发现这种红移现象4。我们 以荧光峰A和荧光峰B（ A:Ex/Em=470/540nm;B:Ex/Em=340/460nm）来描述高浓 度腐殖酸荧光强度与PH值的关系，可以看到（图4b），在酸性条件下，峰B的 荧光强度略大于峰A;而在碱性条件时，峰A的荧光强度明显大于峰B，这种情 形表现在3DEEM中，荧光峰A就把荧光峰B给掩盖住，似乎只有一个荧光峰存 在。有趣的是，我们可以看到荧光峰B在Fluka HA浓度为50mg/L和100mg/L 时，其荧光强度最大值出现在PH约为5.0处，而不像其他溶解有机质的荧光

21、强 度最大值出现在10左右。在本文中，荧光峰B（Ex/Em=340/460nm）属于类富里 酸荧光5。而且，在PH=5.0-12范围内，荧光峰B的荧光强度呈略微下降趋势。 有报道说土壤富里酸的同步荧光光谱在PH=4.5-10范围内也呈下降趋势，而河 流富里酸和泥炭富里酸的荧光强度则呈略微上升趋势。这种情况表明，可以利 用荧光峰B的荧光强度随PH值的变化规律来判断腐殖质的来源。实验结果显示， 荧光峰A（Ex/Em=320/444nm）和荧光峰B（Ex/Em=235/434nm）的荧光强度最大值也 出现在PH=5左右，在PH =Ip; A. hi. pH（ 1，式中廿l 川 为低 mi直区网最满,

22、n 时的荧光弦J斐 为低pH值豆何鼠：底I科的荧光强度尬捣6式（1）和图4b,可以算出Fluka HA浓度分别为50mg/L和100mg/L时，其荧光 峰B的质子化常数分别为3.57和3.13，与通常二羧基化合物的质子化常数值 （2.5-4.3）相接近荧光峰表明荧光峰B可能与Fluka HA结构中的羧基有关。2.4荧光峰A和荧光峰B比值r（A/B）在图4b中，荧光峰A和荧光峰B的荧光强度以IA和IB表示，定义 r(A/B)=IA/IB。r(A/B)被认为是一个有机质结构和成熟度的指标，并且与分子 大小、溶液PH等有关，从实验结果得出，当Fluka HA浓度为50mg/L时， r(A/B)在 0

23、.61-1.71 之间；当 Fluka HA 浓度为 100mg/L 时，r(A/B)在 0.62- 2.59之间，这些r(A/B)值与其他研究者的结果相接近。荧光强度以及r(A/B) 强烈依赖于PH，若要比较不同来源腐殖质的r(A/B)，必须在PH相等的条件下 才能进行。我们对Fluka HA的研究结果显示(图5)，当HA浓度为50mg/L时，R平方为 0.98；当HA浓度为100mg/L时，R平方为0.91，说明r(A/B)与PH之间的确具 有线性关系。从图5还可以发现，当PH10时，由于腐殖酸浓度较高，其荧光内滤效应造成了 r(A/B)下降。上述结 果表明，当PH=10时，荧光峰A与荧光峰B随着PH值的改变有着相同的变化 趋势，可能预