血红蛋白电泳及其临床应用

1、血红蛋白电泳及其临床应用鄢盛恺中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院检验科，北京100730早在 60 多年前 Pauling 等（ 1949）在研究镰状红细胞贫血患者的血红蛋白 （ hemoglobin ， Hb ）时就发现其与正常人不同， 证实这种异常的 Hb 在缺氧条件下是产生红细胞镰变和溶血性贫血的原因，并提出了“分子病”这一新概念。引起了人们对Hb 结构异常及异常Hb 与遗传性贫血之间关系的重视。近年来， 由于生化技术和分子生物学技术的不断发展，相继发现和鉴定了许多新型异常的Hb。电泳技术作为分离与鉴定Hb 最简便、准确的方法之一，广泛用于临床遗传性贫血（如地中海贫血）、异常血红

2、蛋白病等疾病的临床诊治。概述Hb 的主要生理功能是将氧气从肺部运送到组织，同时将组织释放的二氧化碳带回到肺部完成氧气和二氧化碳的交换。Hb 是由珠蛋白和亚铁血红素连接成的一种结合蛋白质。每一个 Hb 是由 4 个多肽链组成，而每一肽链又和一个铁卟啉结合。和血红素连接的珠蛋白是一种组蛋白， 每一个珠蛋白分子由4 条肽链组成， 每一条肽链和一个血红素结合，构成一个Hb 单体或称为亚单位。因此，每个Hb 分子是由4 个 Hb 单体聚合而成的四聚体。现在已知人类的红细胞中存在3 种正常的Hb ，即 HbA 、 HbA2 和 HbF 。从正常Hb 中已发现、链、和4 种不同肽链。这些Hb 由均由一对链和

3、一对非链组成。正常成人 Hb 的非链称为链，而胎儿Hb 中的非链称为链。HbA 含量最多，它由两条链和两条链组成； HbA2（占 3%）由两条链和两条链组成。HbF 正常含量是Hb 的 2%，由两条链和两条链组成。除 HbA 、 HbA2 和 HbF 外其他的各种Hb 常被称为异常Hb 。全世界目前已报道的异常Hb 达 450 余种，而且每年还有新的发现。如美国最常见的两种Hb 变异体是HbS 和 HbC ，而 Hb Lepore ， HbE ， HbA2 G-philadelphia等几类很少见。 现已证实这些异常Hb 的不同之处不在于亚铁血红素部分，而在于珠蛋白部分化学结构的差异。主要类型

4、有： 肽链中氨基酸的顺序略有差异。此类型最为多见，约占90%。如 HbS（ HbA HbS 是由于 2 2 22 S），HbC（ HbA HbC 是由于22 2 2C）；各肽链的重新组合或某些正常肽链的缺失。如 HbH （ HbA HbH 是由于 2 2 4） ，Hb Barts（HbA Hb Bart 是s由于 22 4） ； Hb 肽链的融合。如 Hb Lepore 是链的一半（N 端）与链的一端（ C 端）融合而成；肽链中氨基酸增多，可在中间嵌入或在C 端延长。等。以前发现的Hb 皆以英文字母命名，由 AQ （ B 除外，加上 S）。随着新发现的 Hb 越来越多，字母不够用，现规定从 Q

5、 以后的字母不能再用以命名，而以发现地或实验室命名。临床实验室常用的分离和鉴定Hb 的方法有醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、柱层析和一些有关的化学试验。地中海贫血是一种常染色体显性遗传病，是我国南方最常见和危害最大的遗传病之一。应用电泳法鉴别患者血液中 Hb 的类型及含量对于贫血类型的临床诊断及治疗具有重大意义。全自动电泳分析系统的引进将为临床诊断地中海贫血及异常Hb 病提供准确的实验室方法和依据。近年来分子生物学技术已用于因异常Hb 引起的遗传性疾病的基因诊断中。I-11 / 42 Hb 电泳2.1原理Hb 的分离和鉴定方法很多，其中以电泳法最为常用且最为重要，很多异常Hb 都是首先用电

6、泳法发现的。其原理是Hb 中的珠蛋白和其他蛋白质一样为两性电解质，在不同的缓冲液中可带正或负电荷，在电场中向阴极或阳极移动。由于不同的蛋白质之间 （正常 Hb 与异常 Hb ）其等电点、分子大小、形状及所带电荷的不同，其移动速率不同（电泳迁移率不同），在一定的支持介质中可借以分离。 不同的电泳方法具有不同的电场强度、 pH、缓冲液或支持物。2.2常用方法最常用的方法是碱性缓冲液电泳。早期用醋纤膜作为支持介质，在碱性环境下（ pH8.48.6 ）可快速分离HbA 、 HbA2 和 HbF 及其他多种变异体。可是不能将HbS与 HbD 和 HbG 分开，因为后 3 种 Hb 在这一电泳系统中具有相

7、同的迁移率。同样，在碱性条件下， HbC、 HbE 、 HbO 与 HbA2 也有相同的迁移率。 1976 年美国疾病预防与控制中心（CDC ）和美国临床实验室标准化委员会（NCCLS ）曾推荐用醋酸纤维素薄膜电泳（ Helena实验室的方法与之基本相同）作为异常Hb 检测的初级试验。现多用分辨率更高的琼脂糖凝胶进行电泳分析。而酸性缓冲液（pH6.06.2 ）电泳可用来分离那些在碱性缓冲液电泳中不能分离开的 Hb ，如 HbS 及 HbC 。在此酸性条件下，HbD 、 HbO （或 HbE ）与 HbS 及 HbC可明显的分开。电泳后 Hb 可用丽春红 S、酸蓝或氨基黑10B 进行染色，将电泳

8、区带与已知的对照比较，并用光密度计进行扫描定量。对于一些特殊的Hb 如 HbS、 HbA2 、 HbF 和不稳定 Hb （如 HbM 、 HbH 、 HbE 等）可分别采用溶解度试验、柱层析法、碱变性法（Singer法）及不稳定试验（异丙醇试验）进行鉴定。珠蛋白链电泳、等电聚焦和氨基酸序列分析可用来证实稀有的 Hb 存在，多用于研究。目前已有多种自动化电泳分析仪可应用于临床常规Hb 电泳，如 Helena公司的 REP、SPIEF 等型号， Sieba 公司的 HYDRASYS 。其中碱性缓冲液电泳为常用筛选方法。2.3电泳结果2.3.1碱性缓冲液电泳在碱性缓冲液中所有Hb均向阳极移动，其移动

9、顺序为：HbHHbA3 HbA1HbFHbS/HbD/HbGHbC，HbA2/HbC/HbE/HbOCA1CA2（ CA1 为碳酸酐酶 1，CA2 碳酸酐酶 2）。正常人可见4 条区带： HbAHbA2CA1CA2 （若用联苯胺染色， CA1 与 CA2 则不显色）。在点样处有一条蛋白带，它是非Hb 成分，为细胞基质和膜蛋白。2.3.2 酸性缓冲液电泳在酸性缓冲液中， HbA 、HbD 、HbE 和 HbG 向阴极移动，而 HbF比它们更靠近阴极。HbC 向阳极移动得最快，HbS 也向阳极移动，但比较接近点样点。2.3.3结果报告有两种报告方式：定性：将染色后的电泳胶片用质控胶片对比即可判断胶

10、片有无 Hb 。定量：染色后的电泳胶片用光密度计扫描，报告各条带的百分比值。各区带参考值，根据不同年龄有不同的范围。例：正常成人：Hb（ A+F ） 94.5%98.5%HbA22.5%3.5%新生儿 (1 个月 ) ： HbA 12%40%HbF 6%93%HbA2 0.1%1.0%婴儿（ 3 个月）： HbA 1.00% 65.00%HbF34.3% 82.95%HbA20.042%婴儿 (6 个月 )：HbA 86%98%2 / 4HbF 0.84%10.7%HbA2 0.87%2.9%I-23临床意义足月的初生婴儿血液中的约70%80%的 Hb 为 HbF，同时也存在少量的HbA和 H

11、bA2。不久 HbF 浓度迅速下降，同时HbA相应增加，绝大多数于出生后6 个月至 2 年后， HbF降至成人的正常水平。HbA2 增高是轻型地中海贫血的一个重要特征。HbA2 减低见于缺铁性贫血及其它 Hb 合成障碍性疾病 （常见如地中海贫血） 。电泳发现异常 Hb 如 HbH 、Hb Bart s、HbC-S、 HbK 等则可确诊为相应的 Hb 分子病。据广东省人民医院资料统计，该院一年所做Hb 电泳 5800 人次（所有产前检查及贫血待查病人），共检出地中海贫血和异常Hb 病患者1375 人，阳性率 23.7%。其中（ 1）地中海贫血基因携带者（HbH 病患者、 PCR 确诊 -地中海贫

12、血、新生儿Hb Bart s区带者） 1018 人，阳性率17.6%。（ 2） -地中海贫血基因携带者 327 人，阳性率5.6%。 (3)异常 HbJ、 HbK 、HbN 、 HbG 、HbD 和 HbE 共 30 人占总人数 0.52%。3.1 -地中海贫血是由于珠蛋白基因缺失或突变，导致珠蛋白肽链合成障碍所致。我国多数是珠蛋白基因缺失。3.1.1 静止型 -地中海贫血无临床症状、体征、无贫血，红细胞形态正常。HbA2 和HbF 正常，新生儿期可出现 1%3 %Hb Bart s，出生后 3 个月消失。父母任一方有-地中海贫血。3.1.2标准型轻型患者无症状。 呈轻型小细胞低色素性贫血。

13、有轻度红细胞形态改变。HbA2含量为正常低限（ 1.5%2.5% ）， /约 1.4/1 ， HbF 正常。新生儿期HbBart 可达5%8% ， 6 个月完全消失。父母任一方有-地中海贫血。3.1.3HbH 病临床表现有轻、 中度贫血， 2/3 以上病例有肝脾肿大， 常反复出现黄疸。在妊娠、感染及使用氧化剂时，Hb 显著下降。父母双方常有-地中海贫血。实验室检查：有溶血性贫血的特征， 骨髓中红细胞系统增生极度活跃。HbH明显增高（ 2.5 40），HbA2及 HbF 含量正常。 Hb 电泳可出现 HbH 区带。红细胞渗透脆性试验降低，红细胞包涵体阳性。3.1.4Hb Bart 胎s儿水肿综合

14、征临床表现：该病为-地中海贫血中最严重者，胎儿常于妊娠后期死亡或早产。胎儿生下时，全身水肿，皮肤苍白，黄疸，肝脾肿大，常于产后数小时内死亡。父母双方均有HbH 病或标准型 -地中海贫血。实验室检查：有溶血性贫血的特征，骨髓红系增生活跃。红细胞形态靶形红细胞明显增多，外周血可见有核红细胞。Hb 电泳： Hb Bart 成分 80，抗碱Hb 增加，出现少量Hb Portland 或少量 HbH 。3.2 -地中海贫血是由于珠蛋白链合成减少或完全不能合成所致。 完全不能合成珠蛋白链的地贫基因称为 0，合成减少的称为 +。3.2.1重型临床表现：又称库利氏贫血（Cooleyanlsnua）患者症状严重

15、，多在儿童期夭折。少数症状较轻， 可活至成年， 此型又常称为中间型。 库利氏贫血在婴儿期 69 个月开始出现贫血，黄疸、肝脾肿大。儿童患者发育不良、智力迟钝、骨骼改变如颧骨隆起，眼距增宽，鼻梁低平。 线可见外板骨小梁条纹清晰呈直立的毛发样等。多在幼儿时死于重度贫血或感染。若能生长超过10 岁，可出现个体矮小，性功能、甲状腺及甲状旁腺等功能低下，可继发血色病，出现心律系乱、心力衰竭、肝硬化、糖尿病等。父母常均有轻型?-地中海3 / 4贫血。 实验室检查：Hb30 。3.2.2轻型临床表现：无症状或有轻度分血症状，肝脾无肿大或轻度肿大。父母一方为 -地中海贫血杂合子。实验室检查：Hb稍降低或正常，

16、外周血少量靶形细细胞。HbA13.5 ， HbF 轻度增加（不超过5）。3.2.3中间型临床表现： 症状和体征介于重型和轻型?-地中海贫血之间。 实验室检查：I-3同重型 ?-地中海贫血。遗传学：父或母均为 ?-地中海贫血杂合子状态。根据临床表现，小细胞低色素性贫血， Hb 电泳及 HbF 、HbA2 含量测定有家族史，一般不难作出诊断。3.3 异常 Hb 病异常 Hb 病指因正常成人 HbA 的产生受到部分或完全的抑制，被另一种或几种异常的Hb 部分或完全取代而产生的病症，例如HbS 和 HbC 等常与溶血性贫血、镰状红细胞或靶形红细胞等特征联系在一起。实际上，某些异常Hb 的存在，并不引起生理上的任何特征，也并不是所有异常 Hb 携带者都有特殊的临床表现。有些异常Hb 携带者，可以终生健康地生活，仅在居民普查或因其它疾病就医时才被发现。当然，这些 Hb 变异体仍有其生物化学、遗传学及人类学意义。那些有临床意义的异常Hb，涉及到预防，治疗等一系列问题。早期发现的一些 Hb 变异体，如 Hb 、等，多出现在溶血性贫血患者身上。现在看来，有一些可能伴有地中海贫血。镰状细胞贫血是由纯合子HbS 引起的是一种很严重且致命的疾患， 患婴多在 56 个月时就会出现临床症状，如疼痛、 发热，并随着病情的恶化而加重，患者全