华中农业大学植科院博士生资格考试复习资料

1、一 全基因组策略1、什么是分子育种？所谓分子育种主要包含两部分内容：一是分子标记辅助育种，二是基因工程或者叫转基因。其中，分子标记辅助育种是将生物技术与传统育种技术相结合而形成的，在水稻、小麦、玉米、大豆、油菜等重要作物上，通过寻找与重要农艺性状紧密连锁的DNA分子标记，从基因型水平上实现对目标性状的直接选择，从而加快育种进程，提高育种效率，选育抗病、优质、高产的品种。与转基因技术不同，分子标记育种技术是利用现有的种质资源开展玉米种质改良和育种研究，不存在安全性和市场排斥等社会性和生态性风险。分子标记辅助选择技术在各玉米种业跨国公司已成为常规技术，极大地提高了育种效率。2、什么是全基因组选择？

2、2001年，全基因组选择的概念被提出，即估计全基因组上所有标记或单倍型的效应，从而得到基因组估计育种值。与传统的标记辅助选择的最大区别在于，全基因组选择不仅仅依赖于一组显著的分子标记，而是联合分析群体中的所有标记，以进行个体育种值的预测。在作物遗传育种领域，全基因组选择应用于小麦秆锈病持久抗性和产量等复杂性状的遗传改良已有研究报道。与传统的分子标记辅助选择相比，全基因组选择有两大突破，一是基因组定位的双亲群体可以直接应用于育种；二是更适合于改良由效应较小的多基因控制的数量性状。农作物复杂性状的分子育种需要理解和操控许多因素，其中包括植物生长、发育和对各种生物和非生物逆境条件的反应。通过全基因组

3、策略分子标记辅助育种的操作更加容易，并由此产生革命性影响。全基因组策略的分子标记辅助育种利用全基因组测序和全基因组分子标记对代表性的或者全部遗传资源和育种材料进行分析，有效地考虑分子育种中面临的各种基因组和环境因素。基于对特定基因组区域，基因/等位基因，单倍型，连锁不平衡块，基因网络和这些因素对特定表型贡献的理解，这样的策略正在日益增加。大规模高密度的基因型鉴定和全基因组选择是该策略的两个重要组成部分。高通量和精确的表型鉴定和环境测试（e-typing）也是全基因组策略的重要组成部分。应该此基础上重构有较强的支持系统（例如育种信息学和设计支持工具）的分子育种平台和方法。在这篇文章中讨论了一些基

4、本策略，其中包括（1）基于种子DNA的基因型鉴定，简化分子标记辅助选择，降低育种成本、增加规模和提高效率，（2）选择性基因型鉴定和表型鉴定，结合DNA混合池分析，捕获和育种相关的大多数重要因素，（3）灵活的基因型鉴定系统，例如通过测序和芯片进行基因型鉴定，对不同的选择方法进行细化，包括分子标记辅助选择，分子标记辅助轮回选择和基因组选择，（4）结合连锁作图和LD作图的方法进行标记-性状关联分析，以及（5）基于序列的策略进行分子标记开发，等位基因发掘，基因功能研究和分子育种。二 简述一种基于蛋白质水平分析植物基因表达的方法技术原理及应用。常用的方法有双向凝胶电泳联合质谱方法、鸟枪法LC-MS质谱鉴

5、定、抗体芯片方法等。双向凝胶电泳联合质谱的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS- PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。胶染色后可以利用凝胶图像分析系统成像，然后通过分析软件对蛋白质点进行 HYPERLINK /view/180744.htm t _blank 定量分析，并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。通过专门的蛋白质点切割系统，可以将蛋白质点所在的胶区域进行精确切割。接着对胶中蛋白质进行酶切消化，酶切后的消化物经脱盐/浓缩处理后就可以通过点样系统将蛋白质点样到特定的材料的表面（MALDI-TOF）。最后这些蛋白质就可以在质谱系统

6、中进行分析，从而得到蛋白质的 HYPERLINK /view/2822803.htm t _blank 定性数据，通过与已有的数据库进行比对确定候选蛋白。鸟枪法LC-MS质谱鉴定的基本原理是，蛋白质混合物经过简单或不经过SDS分离就被酶切消化成肽段混合物，肽段混合物经过高效液相色谱分离形成较简单的组分，然后将其导入高分辨率质谱仪中进行质量分析。肽段在质谱仪中经离子化后，带上一定量的电荷，通过质量分析器的分析，可检测个肽段的质量与电荷的比值。通过与数据库匹配进行肽段鉴定，最后再从鉴定的肽段推导可能的蛋白。抗体芯片方法抗体芯片是蛋白芯片的一种。它的基因原理是首先制备目标蛋白的特异性的抗体，将不同的

7、蛋白样品用荧光分子标记，再与抗体芯片杂交，杂交信号强弱反应了蛋白的表达水品高低。这三种技术可用于分析作物的不同品种，或不同生理、病理条件下蛋白组的表达差异，有助于鉴定出影响作物品质、抗逆性、产量等形状的重要的蛋白用于植物育种中。三 下一代测序技术的种类、原理进入21世纪后，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。1）、454技术原理 待测DNA文库的构建 。把待测序列用喷雾法(nebulization)打断成300-800 bp的小片段并在小片段两端加上不同的接头，或将待测序列变性后用杂交引物进行PCR扩增，

8、连接载体，构建单链DNA(ssDNA)文库。 Emulsion PCR。将这些ssDNA与水油包被的直径大约28 m的磁珠在一起孵育、退火，由于磁珠表面含有与接头互补的寡聚核苷酸序列，因此ssDNA会特异地连接到磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，因此可以保证每一个与磁珠结合的小片段都会在各自的孵育体系内独立扩增, 扩增产物仍可以结合到磁珠上。反应完成后，破坏孵育体系并富集带有DNA的磁珠。经过扩增反应，每一个小片段都将被扩增大约100万倍，从而达到下一步测序反应所需的模板量。 测序。预 先 用 B a c i l l u s stearothermophilus 聚合酶和单链结合蛋白处

9、理带有DNA的磁珠，然后将磁珠放置在一种叫做PicoTiterPlate(PTP)的平板上。PTP板上含有很多直径约为44 m的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法固定每个磁珠的位置以监测接下来的测序反应。测序反应采用焦磷酸测序法，将一种含有比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔，启动测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增的ssDNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果这种dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化酶反应形成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化反应体系中的荧光素分子并发出荧光。测序反应产生的荧光信号由放

10、置在PTP板另一侧的CCD照相机记录，再经过计算机分析转换为测序结果。由于每种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同，因此可以根据荧光的颜色来确定被测分子的序列。2）Illumina公司的Solexa技术 待测DNA文库的构建把待测序列打断成200-500 bp的小片段，并在小片段两端加上不同的接头，连接载体，构建ssDNA文库。 D N A 与 流 动 槽 （ f l o w cell）的附着将这些ssDNA随机地附着在流动槽表面的channel上。流动槽是一种含有8个channel的微纤维板，它的表面固定有很多接头，能支持ssDNA在其表面进行桥式扩增。Bridge PCR向反应体系中添加未标

11、记的核苷酸和酶，进行Bridge PCR扩增反应。Bridge PCR以流动槽表面固定的接头为模板，经扩增将桥型ssDNA扩增成桥型dsDNA。 dsDNA的变性 将桥型dsDNA变性成ssDNA，继续扩增。经过不断的扩增变性循环，每一种ssDNA都在各自的位置集中成束（cluster），每一个束含有单个模版分子的500-1000个克隆拷贝，从而达到能支持下一步测序反应所需信号强度的模板量。 测序 测序方法采用边合成边测序的方法（SBS）。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP。由于这些dNTP的3羟基被化学方法保护，因而每轮合成反应都只能添加一个dNT

12、P。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱。加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，用光学设备完成荧光信号的记录，再通过计算机分析转化为测序结果。当荧光信号的记录完成后，加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP的3羟基保护基团，以便进行下一轮测序反应。3）ABI公司的SOLiD技术 待测DNA文库的构建 把待测序列打断成很小的片段，并在小片段两端加上不同的接头，连接载体，构建ssDNA文库。 Emulsion PCR。 与454技术的Emulsion PCR类似，将带接头的ssDNA固定在磁珠表面，进行PCR扩增，并对扩增产物进行3端修饰。 连接酶测序

13、。将3端修饰的磁珠沉积于上样玻片（slide），进行连接酶测序。在沉积过程中可对磁珠密度进行调节，以达到最大通量。体系中加入DNA连接酶、通用测序引物n和具有3-XXnnnzzz-5结构的八聚核苷酸。在这个八聚核苷酸中，第1和第2位（XX）上的碱基是确定的，并根据种类的不同在第6-8位（zzz）上加了不同的荧光标记。这种由两个碱基决定的测序方法被称为两碱基测序（two base encoding）。当八聚核苷酸由于第1和第2位配对而被连接酶连接上时，会发出荧光。在记录下荧光信息后，通过化学方法在第5和第6位之间进行切割，淬灭荧光信号，以进行下个位置的测序。通过这种方法，每次测序的位置都相差五位

14、，即第一次测第1和第2位，第二次测第6和第7位在测到末尾后，将新合成的链变性、洗脱。而后用通用测序引物n-1进行第二轮测序。第三代测序技术Helicos公司的Heliscope单分子测序仪基于边合成边测序的思想，将待测序列随机打断成小片段并在3末端加上Poly(A)，用末端转移酶在接头末端加上Cy3荧光标记。用小片段与表面带有寡聚Poly(T)的平板杂交。然后，加入DNA聚合酶和Cy5荧光标记的dNTP进行DNA合成反应，每一轮反应加一种dNTP。将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱，检测上一步记录的杂交位置上是否有荧光信号，如果有则说明该位置上结合了所加入的这种dNTP。用化学试剂去掉荧

15、光标记，以便进行下一轮反应。经过不断地重复合成、洗脱、成像、淬灭过程完成测序。四 转基因技术的研究进展五 基于转录本分析植物基因表达的技术和应用RNA-seq技术 见下载的两篇文献六 群体改良1 群体改良的原理，意义，轮回选择的目的，意义，步骤，作用。群体改良原理：1）Hardy-Weinberg定律（基因平衡定律）：在一个完全随机交配的群体内，如果没有其它因素干扰时，则基因和基因型的频率保持恒定，各世代不变。在一个有性生殖的自然种群中，在符合以下5个条件的情况下，各等位基因的频率和等位基因的基因型频率在一代一代的遗传中是稳定不变的：1,种群大；2,种群中个体间的交配是随机的；3,没有突变发生

16、；4,没有新基因加入；5,没有自然选择。2）选择与重组是群体改良的动力。从育种角度来看，选择和基因重组是群体基因和基因型频率改变主要动力和因素。利用群体进化的法则，通过异源种质的合成，自由交配、鉴定选择等手段，促进基因重组，不断打破优良基因与不良基因的连锁，提高群体优良基因频率和基因型频率，提高育种效率和育种水平。群体改良意义：创造新的种质资源；选育优良的综合品种；改良外来种质的适应性。2 自花授粉作物群体改良方法对自花授粉作物或常异花授粉作物进行群体改良工作的关键在于实行生殖控制，即将自花授粉作物异交化，或提高常异花授粉作物的异交程度。可通过导入雄性核不育基因建立异交群体。3 提高群体改良效

17、率的方法轮回选择的目的：为育种家提供改良的种质，提高育种群体中的有利基因频率。轮回选择的意义：通过循环式多次交替进行选择和杂交改进作物群体遗传结构，以提高群体中有利基因频率的育种方法。改良的群体可直接用于生产，也可从中选出具有更多有利基因的品种、自交系或综合种。轮回选择的方法：混合轮回选择法；改良穗行选择法；自交后代选择法；半同胞轮回选择；全同胞轮回选择。轮回选择的步骤：确定或合成一个原始杂种群体；从原始群体中选择具有目标性状的个体；当选的优良个体互交，重组，形成一个新群体；再从新群体中进行鉴定和选择，进行另一个新的轮回周期。轮回选择的作用：提高群体内数量性状有利基因频率；打破不利的基因连锁，

18、增加有利基因重组的机会，使有益基因聚合；使群体不断得到改良并保持较高的遗传变异水平，增强适应性，以供进一步选择之用；作为育种工作的战略思想，把短期的和中期、长期的育种目标结合起来七 传统育种方法的缺陷，利用转基因和基因组学如何克服传统育种的缺陷传统育种的主要缺陷：1）农艺性状的转移很容易受到种间生殖隔离的限制，不同物种间的优良基因，很难加以利用。2）通过有性杂交进行基因转移，不能准确地对某个基因进行操作和选择，易受不良基因连锁的影响。3）利用有性杂交转移基因的成功与否一般需要依据表观变异或生物测定来判断，检出效率易受环境因素的影响。4）利用传统育种所获得的抗性，易受品种和地域环境的影响。即在北

19、方培育的抗逆新品种，种植到南方，可能其抗逆性表现不明显。转基因育种具有明显的优势：1）生物育种所利用基因资源不受物种的限制，不同植物之间、乃至微生物、动物界的基因都可以加以应用。因此极大丰富了可利用的基因资源，为新品种的培育提供无限可能。2）生物育种能准确地对某个基因进行操作和选择，也可同时转入多个基因。3）转基因育种有的放矢，利于目标性状品种的检测。4）对于功能明确，具有实用价值的基因，利用转基因技术进行育种，可使其功能在同一物种的不同品种间得到稳定表现，即所获得的性状不易受品种差异及地域环境差异的影响。分子标记辅助选择育种以及全基因组策略分子标记辅助选择(MAS，markerassiste

20、d selection)是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。目前，MAS技术应用主要集中在基因聚合(Gene pyramiding)、基因渗入(Gene transgression)、根据育种计划构建基因系等方面。分子标记辅助选择分为前景选择和背景选择。前景选择是对目的基因的选择，要求标记与目标基因紧密链锁，或者是直接标记目的基因，这样可以确保前景选择的可靠性。背景选择是指对基因组中除了目标基因的其他部分及遗传背景进行选择，其选择的对象几乎包括了整个基因组。传统育种存在的缺陷：种间农艺性状的

21、转移容易受到种间生殖隔离的限制；通过杂交进行转移优良基因的时候，容易受到连锁累赘的影响；优良基因转移成功与否依赖于表型的鉴定，受到环境的影响大转基因育种：转基因技术可针对目标性状精确改良，不仅省时而且可打破物种的界限，充分利用遗传资源分子标记辅助选择育种： MAS 育种的本质是通过与目标性状紧密连锁的( 或目标性状基因序列本身的) 分子标记进行选择从而达到选择目标性状的目的。与目标性状相关联的 QTL /基因分离出以后，可通过标记辅助回交将其转育至优良背景中，即在标记辅助回交过程中，利用已知的标记选择含有最大比例的轮回亲本基因组和最小限度的供体染色体片段的回交后代。以往回交育种过程中，回复轮回

22、亲本基因组需要回交 8 代，而标记辅助回交可将回交代数减少至 3 代就可获得理想个体。与传统育种比的有点传统育种过程是对农艺性状进行选择的过程，这些性状多为数量性状，受多位点控制，且受环境影响大。而 MAS 是在 DNA 水平的选择，不受环境影响; MAS 不受作物发育阶段影响，可在作物的任何生长发育阶段 ( 甚至种子阶段) 进行操作，不必等到成熟时或发病时选择，大大加速了育种进程; 分子标记选择的判别方式为“是”与“否”，与离散的、模糊的数量性状选择相比，该优势更为突出。尤其是功能标记可对目标基因或数量性状位点进行直接选择，不受育种过程中目标性状 QTL /基因与标记间遗传重组的影响，由此可

23、大大提高选择的效率和准确性。分子设计育种：在分子标记辅助育种的基础上，随着近年来大量基因组序列数据、高通量基因型和植物表型鉴定技术的发展，众多重要性状功能基因的发掘，以及对分子标记与目标性状关系的深入了解进一步催生了设计育种的概念，即育种家可以根据需要，在电脑上进行模拟，从而设计出理想基因型的品种。分子设计育种在新基因挖掘、定向引入 /改良目标性状、创制新种质材料、改造亲本材料、缩短育种年限、提高选择准确度、提高杂种优势利用率等方面具有传统育种方法不可比拟的优越性。智能不育杂交制种技术：隐性核不育的不育性稳定且任何自交系 /品种均可作为其恢复系，因难以保持和扩繁而无法在杂交育种中直接应用。智能

24、不育杂交制种技术利用现代生物技术，将玉米花粉育性恢复基因、花粉失活基因和红色荧光蛋白标记基因组合在一起构建遗传转化载体，通过转基因技术导入到玉米隐性核雄性不育系中，该转基因株系自交后，产生 50% 的不育系种子( 非红色荧光种子) 和 50% 的保持系种子( 红色荧光种子) ，通过机械色选技术有效地将两部分种子分离，正常颜色种子可以繁殖为不育系，用于玉米杂交育种和杂交制种; 红色荧光种子自交可源源不断地产生其本身和正常颜色不育系种子，从而实现一系两用的目的。智能不育技术有如下几个方面的优势: 智能不育系不育性稳定，不受环境影响，保障了杂交种纯度及制种安全; 配组自由，可以大大提高杂种优势的资源

25、利用率; 智能不育系不育性状遗传行为简单，不受遗传背景影响，易于开展优良性状的聚合育种，快速选育出优质、高产、多抗、广适的杂交组合，有利于扩大杂交种适应区域; 育性恢复基因与花粉失活基因紧密连锁，不仅阻断了转基因成分通过花粉漂移，而且实现了用转基因手段生产非转基因不育系种子和杂交稻种子。八 关联分析原理及基本步骤，在育种中的应用，常见问题及解决方法全基因组关联分析(Genome-wide association study;GWAS)是应用基因组中数以百万计的单核苷酸多态性(single nucleotide ploymorphism，SNP)为分子遗传标记，进行全基因组水平上的对照分析或相关

26、性分析，通过比较发现影响复杂性状的基因变异的一种新策略。随着基因组学研究以及基因芯片技术的发展，人们已通过GWAS方法发现并鉴定了大量与复杂性状相关联的遗传变异。近年来，这种方法在农业动物重要经济性状主效基因的筛查和鉴定中得到了应用。全基因组关联方法首先在人类医学领域的研究中得到了极大的重视和应用，尤其是其在复杂疾病研究领域中的应用，使许多重要的复杂疾病的研究取得了突破性进展，因而，全基因组关联分析研究方法的设计原理得到重视。人类的疾病分为单基因疾病和复杂性疾病。单基因疾病是指由于单个基因的突变导致的疾病，通过家系连锁分析的定位克隆方法，人们已发现了囊性纤维化、亨廷顿病等大量单基因疾病的致病基

27、因，这些单基因的突变改变了相应的编码蛋白氨基酸序列或者产量，从而产生了符合孟德尔遗传方式的疾病表型。复杂性疾病是指由于遗传和环境因素的共同作用引起的疾病。目前已经鉴定出的与人类复杂性疾病相关联的SNP位点有439个。全基因组关联分析技术的重大革新及其应用，极大地推动了基因组医学的发展。动物重要经济性状即复杂性状GWAS分析方法的原理是，借助于SNP分子遗传标记，进行总体关联分析，在全基因组范围内选择遗传变异进行基因分型，比较异常和对照组之间每个遗传变异及其频率的差异，统计分析每个变异与目标性状之间的关联性大小，选出最相关的遗传变异进行验证，并根据验证结果最终确认其与目标性状之间的相关性。GWA

28、S的具体研究方法与传统的候选基因法相类似。最早主要是用单阶段方法，即选择足够多的样本，一次性地在所有研究对象中对目标SNP进行基因分型，然后分析每个SNP与目标性状的关联，统计分析关联强度。目前GWAS研究主要采用两阶段或多阶段方法。在第一阶段用覆盖全基因组范围的SNP进行对照分析，统计分析后筛选出较少数量的阳性SNP进行第二阶段或随后的多阶段中采用更大样本的对照样本群进行基因分型，然后结合两阶段或多阶段的结果进行分析。这种设计需要保证第一阶段筛选与目标性状相关SNP的敏感性和特异性，尽量减少分析的假阳性或假阴性，并在第二阶段应用大量样本群进行基因分型验证。虽然 GWAS结果在很大程度上增加了

29、对复杂性状分子遗传机制的理解,但也显现出很大的局限性。首先，通过统计分析遗传因素和复杂性状的关系,确定与特定复杂性状关联的功能性位点存在一定难度。通过GWAS发现的许多SNP位点并不影响蛋白质中的氨基酸,甚至许多SNP位点不在蛋白编码开放阅读框(open reading frame,ORF)内,这为解释 SNP位点与复杂性状之间的关系造成了困难。但是，由于复杂性状很大程度上是由数量性状的微效多基因决定的,SNP位点可能通过影响基因表达量对这些数量性状产生轻微的作用，它们在RNA的转录或翻译效率上发挥作用，可能在基因表达上产生短暂的或依赖时空的多种影响，刺激调节基因的转录表达或影响其RNA剪接方

30、式。因此，在找寻相关变异时应同时注意到编码区和调控区位点变异的重要性。其次，等位基因结构 (数量、类型、作用大小和易感性变异频率)在不同性状中可能具有不同的特征。在GWAS研究后要确定一个基因型-表型因果关系还有许多困难，由于连锁不平衡的原因，相邻的SNP之间会有连锁现象发生。同样，在测序时同样存在连锁不平衡现象，而且即使测序的费用降到非常低的水平，要想如GWAS研究一般地获得大量样本的基因组数据还是非常困难的。但是，随着基因组研究和基因芯片技术的不断发展和完善，必将迎来GWAS的广泛应用。关联分析以连锁不平衡为基础鉴定某一群体内性状与遗传标记或候选基因间的关系。连锁不平衡是不同基因座位上等位

31、基因的非随机组合。当位于某一座位的特定等位基因与同一条染色体另一座位的某一等位基因同时出现的几率大于群体中因随机分布而使两个等位基因同时出现的几率时,就称这两个座位处于LD状态。与连锁分析相比,关联分析优点有三,(1)花费的时间少,一般以现有的自然群体为材料,无需构建专门的作图群体。(2)广度大,可以同时检测同一座位的多个等位基因。(3)精度高,可达到单基因的水平关联分析的基本步骤：群体选择； 估算群体结构；性状考察；多态性检测；统计分析.关联分析的应用：1关联分析进行功能基因的验证，对那些很难通过遗传转化验证基因功能的基因位点，2关联分析进行功能标记的开发，从而用于标记辅助选择。开发过程：在

32、多个材料中对目标性状进行调查,对目标基因进行序列分析,结合性状和基因序列信息进行基于连锁不平衡的关联分析，开发最优等位基因的功能标记3关联分析进行数量性状的研究，全基因组关联分析可定位到更多的QTLs，候选基因关联分析可用于寻找最优的等位基因型影响关联分析的因素1 标记数量，在全基因组扫描中,用标记对目标性状表型变异有贡献的所有座位进行扫描,需要大量分子标记。解决办法：1利用LD 程度高的群体进行全基因组关联分析, 可减少使用的标记数量。2连锁分析和关联分析相结合，根据连锁分析的结果，选择效应值比较大的QTL位点，利用更多的标记对自然群体进行LD 分析，对目标位点进行精细定位，然后根据已知基因

33、组的信息选择适当的候选基因进行关联分析。2 群体结构，指的是一个群体内存在多个亚群。亚群的混合使整个群体的LD强度增强,可能导致不连锁的多态性基因位点与性状的关联,从而得出假阳性结果。解决办法：利用大量的不连锁、随机分别的SSR或RFLP标记对群体进行分析，再用统计方法消除群体结构和假阳性3 LD 衰减距离，LD 衰减距离越小，用更多的分子标记分析九 高通量基因型分型的含义及其在遗传研究中的应用高通量基因型分型就是使用基因芯片及新一代测序技术发掘序列多态性，主要是SNP标记，目前SNP主要以三种形式存在，转换（A/G, C/T）,颠换（A/T,A/C,G/C,G/T）及插入缺失（InDel）。

34、在遗传研究中的作用：1利用高通量基因型分析来迅速构建高密度的遗传连锁图谱，较常规的基于PCR的标记分析通量更高，更省时省力。在遗传图谱构建中高通量的基因分型方法可以更精准地检测出群体中的重组事件并确定重组断点，最终提高遗传图谱的分辨率，有利于更加精准的定位QTLs。2 在基于自然群体的全基因组关联分析中，高通量的SNP技术更加能显示其通量高，省时省力的优势，也只有高通量的基因型分析产生的大批量分子标记才能适合全基因组关联分析 3 更方便构建材料的DNA指纹图谱分析，用于品种的系谱来源研究及纯度分析十 例举一种生物技术在抗病和抗逆育种中的应用2.3 转基因与油菜抗虫抗病病虫害是造成油菜减产的重要

35、原因，仅依赖于化学方法的抗病虫害手段难以达到理想的效果，并且需要耗费大量的人力和物力。通过传统选育的抗病虫害品种往往抗性不够强，或者抗性难以维持，而通过转基因手段获得的植株往往抗性强，且抗性持久。Steward等将Bt cryIAc转入油菜，得到了抗小菜蛾的转基因植株（Steward et al., 1996）。Wang等将昆虫特异的几丁质酶基因chi（chitinase）和蝎毒素基因BmkIT共转入油菜中，BmkIT是一种昆虫神经毒素，对许多鳞翅类昆虫剧毒，由此获得的转基因植株抗虫能力有了大幅度提高（Wang et al., 2005）。王新发等将构建的几丁质酶和-1, 3-葡聚糖酶基因的双

36、价表达载体转入甘蓝型油菜，大田鉴定结果显示转基因植株发病率较对照减少了78%以上，并且抗性能在后代中稳定遗传（王新发等，2005）。2008年Dong等将小麦的草酸氧化酶基因OXO（Oxalate oxidase）转入油菜，获得的转基因植株降解草酸的能力增强，菌核病抗性有了显著提高，田间发病率减少了83%以上，比对菌核病具有良好抗性的中油821和中RS083的抗性更强。表明通过遗传转化，引入草酸氧化酶基因是获得抗菌核病油菜的有效途径（Dong et al., 2008）。随后，Wang等通过在油菜中过表达MPK4（mitogen-activated protein kinase）基因，获得的转

37、基因植株对菌核病和灰霉病的抗性均有显著提高（Wang et al., 2009）。2010年，Yajima首次通过将重组的病原菌特异抗体scFv转入油菜，获得了抗菌核病的转基因油菜（Yajima et al., 2010）；Borhan等将从拟南芥中分离的白锈病抗性基因WRR4（其对白锈病的四个病源小种均有抗性）转入白锈病敏感的甘蓝型油菜，使其获得了白锈病抗性(Borhan et al., 2010）。Liu等将甘薯块根特异蛋白（sporamin） 和爪哇拟青霉（Paecilomyces javanicus）的几丁质酶（chitinase）基因共转入油菜中，得到了抗虫能力和抗菌核病能力均显著提

38、高的转化株（Liu et al., 2011）。最近，Fan等将脂质转移酶LTP（Lipid transfer protein）基因转入甘蓝型油菜，LTP具有广谱的抗菌活性，过表达LTP的转基因植株与对照相比草酸的耐受性增强，菌核病的抗性有一定程度提高（Fan et al., 2013）。2.4 转基因与油菜抗非生物逆境随着科学技术的发展，人们改造自然利用自然的步伐更为迫切，环境污染问题也随之而来。土地的酸碱化、重金属污染问题日益增多，面积也在不断扩大，作物面临减产甚至死亡的威胁。油菜作为重要的食用油来源，为了满足巨大的需求，培育具有抗非生物逆境的品种已成为育种的一项重要目标。Misra等将人

39、类的MT-（metallothionein-）基因转入油菜中，获得的转基因植株在含有100M镉的条件下仍能正常生长，而对照植株表现出根和茎生长受到严重抑制、叶片黄化等现象（Misra et al., 1989）。Reisinger等在油菜中过表达-ECS（-glutamylcysteine synthetase）和GS（glutathione synthetase），获得的过表达植株体内谷胱甘肽和植物螯合肽的含量显著增加。植株不仅对镉表现出抗性，还同时对砷、铬、铅等多种金属具有抗性，为提高植生整治能力提供了良好的借鉴作用（Reisinger et al., 2008）。Bhuiyan等将酵母的

40、YCF1（cadmiumfactor 1）和拟南芥的ATM3（ABC trans-porters of the mitochondria 3）分别转入芥菜型油菜，转基因植株对镉和铅的抗性均有了明显提高（Bhuiyan et al., 2011a; 2011b）。这些研究，均为油菜的抗重金属改良提供了重要的信息。与此同时在油菜抗盐碱方面，Prasad等将胆碱氧化酶基因codA（choline oxidase）转入油菜中，使油菜获得合成甜菜碱的能力。由于甜菜碱对维持细胞渗透压以及稳定光和系统有重要作用，因而转基因植株有较强的抗盐胁迫能力（Prasad et al., 2000）。Zhang等将拟南

41、芥液泡的NHX1（Na+/H+ antiport）基因转入油菜，获得的转基因油菜在200mM NaCl条件下仍能正常生长，且产量和品质均未受到影响（Zhang et al., 2001）。Pan等将耐辐射球菌的IrrE基因转入油菜，转基因植株能耐受高达350mM NaCl。转基因植株在盐处理六周后移入大田，其农艺性状良好，与对照相比并无明显差异（Pan et al., 2009）。Saxena等通过在油菜中过表达型乙二醛酶基因（glyoxalase II），提高了油菜的抗盐胁迫能力（Saxena et al., 2011）。Wang等将柠檬酸合酶基因CS（citrate synthase）转入

42、甘蓝型油菜，赋予了转基因植株在酸性土壤中的生存优势，表现为耐铝胁迫和对土壤中磷的利用效率提高（Wang et al., 2013）。十一 RNAi技术在植物基因功能研究中的应用摘要 RNAi技术是研究基因功能的重要工具。其原理是对某个已知基因，设计诱导其沉默的dsRNA，通过合适手段导入细胞或机体使产生干涉效应的信号分子siRNA，导致基因表达水平下降或完全沉默。通过基因表型变化，鉴定该基因功能。从RNAi的研究背景和作用机制出发，对近年来利用RNAi技术研究植物基因功能的概况、诱导方法和载体作一综述。关键词 基因沉默；RNAi技术；植物基因功能1 RANi的研究背景1998年，Fire等1发

43、现，过去利用正反义RNA阻断基因表达都是因体外制备的单链RNA中污染极少量双链RNA（dsRNA）所引起的，并发现在线虫中导入dsRNA，mRNA明显减少，推论存在某种机制特异地破坏降解内源mRNA，导致某个基因沉默，即转录后基因沉默（PTGS）。在此情况下，启动子是活跃的但不能正常积累mRNA。这种现象被称为RNA干涉（RNAi）。研究表明RNAi现象广泛存在大多数真核生物中，起到自行监控细胞中异常的mRNA、封闭该基因表达、抵御病毒感染及阻断转座子的作用。RNAi技术是将人工合成或载体表达的小的双链RNA（siRNA）导入真核细胞，促使内源RNA降解，高效特异阻断体内特定基因的表达，诱使细

44、胞表现出特定基因缺失表型，获得功能丧失或降低的突变体。RNAi技术具有高度的特异性和高效的干扰活力，是研究基因功能的强有力的工具而被广泛应用。2 RNAi的作用机制对模式生物的研究发现2，生物体内外源或内源的dsRNA经酶切，可形成具有5末端磷酸基、3末端羟基和2个突出的单链核苷酸的信号分子siRNA，诱发RNAi机制。最近研究中还发现，在植物中除了转录后水平沉默（PTGS），RNAi也能在基因的转录水平（TGS）上发挥作用。2.1酶的作用参与RNAi发生的Dicer酶特异识别dsRNA，该酶依赖ATP，能将转基因和病毒感染等引入的dsRNA，逐步切割成含21-23个核苷酸siRNA，启动细胞

45、内RNAi反应。RNAi过程的另一种重要的酶是RNA指导的RNA聚合酶（RdRP）。RdRP的作用，使进入细胞内的dsRNA数量呈指数级扩增，RNAi效应得以放大。故少量dsRNA可使大量靶mRNA大幅度下调。2.2RNAi过程dsRNA进入细胞后，在Dicer酶作用下被裂解成siRNA，双链解开为单链，并和某些蛋白质相结合形成RNA诱导的沉默复合体（RISC）。在ATP的作用下，活化解链siRNA指导活化的RISC分裂靶mRNA。另外，在RdRP作用下，以siRNA为模板合成mRNA互补链，结果mRNA变成dsRNA，在Dicer酶的作用下被切成siRNA，重复进行分裂靶mRNA。3 RNA

46、i技术在植物基因功能方面的研究RNAi被生物学家称为生物体在基因组水平上的免疫系统，也为植物基因功能的研究提供了新的思路和技术平台，即利用RNAi技术进行逆向基因分析。针对某个已知的基因，设计可诱导其沉默的双链RNA，通过合适的手段导入细胞或机体，使该基因表达水平下降或完全沉默。观察基因表型的变化，鉴定基因在基因组中的功能。这仅仅是使表达暂时降低或抑制，基因的信息仍是完整的。最初在植物中研究RNAi的实验是使水稻中报告基因GUS沉默，来比较正义链、反义链及dsRNA诱导RNAi效率的高低。近年来利用RNAi技术在水稻、拟南芥、芸薹属、油菜、烟草及棉花上，已经进行了一些基因功能验证的相关研究3。

47、其中研究最深入的是应用RNAi技术进行大规模拟南芥功能基因组的分析，以获得拟南芥全基因组高质量的基因序列标签（GST）4。3.1植物体中的RNAi诱导方法研究表明，在植物体中，信号分子siRNA可通过植物的维管系统运输。通过韧皮部进行长距离运输或通过胞间连丝进行细胞与细胞之间的转运。将目标基因特异性序列以正向和反方分别插入标记基因或内含子的5端和3端，再在一端连接一个启动子，用转基因技术将反式重复的外源基因导入生物体，诱导表达发夹结构的转录产物RNA（iphRNA），能产生稳定遗传的RNAi现象5，其诱导目的基因沉默效率高，适用性广，应用潜力大。dsRNA或iphRNA能通过以下几种方法呈递到植物体内。3.1.1微弹轰击法。将dsRNA或含内含子的发夹结构RNA（iphRNA）表达载体显微注射入植物体内。3.1.2农杆菌介导法。将带有能转录成ihpRNA的反式重复的外源基因的T-DNA质粒，通过农杆菌介导整合到植物基因组上。3.1.3病毒诱导基因沉默（VIGS）。目标序列整合入病毒基因序列，通过农杆菌介导转化ihpRNA表达。3.2相关的干涉载体Helliwell及其同事利用Invitrogen公司的Gateway重组克隆技术，构建高通量基因沉默的载体系列pHELLSGATE，包括全部拟南芥基因组的