GC-MS在药学研究中技术与应用

1、气相色谱-质谱联用技术第一页，共一百一十页。气相色谱 -质谱联用仪GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spetrum)第二页，共一百一十页。Agilent6890-5975B气质联用仪第三页，共一百一十页。GC-MS概述一、GC-MS的特点二、GC-MS的系统构成三、质谱检测器MSD的组成四、 GC-MS仪的主要信息五、 GC-MS的应用第四页，共一百一十页。一、GC-MS的特点GC的别离特点+质谱的定性特点 三高GC将待测样品进行别离直接导入质谱进行检测质谱检测离子质量，获得化合物的质谱图联用技术可以得到质量、保存时间、强度三维信息第五页，共一百一十页。气质联用数据

2、是三维的125010015020025030011109876Time minutesMass daltons第六页，共一百一十页。气相色谱-质谱联用 特点：要求样品气化后进入质谱仪用电子轰击方式EI得到的谱图，可与标准谱库比照用毛细管色谱柱别离化合物，别离效率高操作条件稳定、使用方法成熟适宜分析小分子、易挥发、热稳定的化合物第七页，共一百一十页。样品别离、鉴定和定量一次完成检测限可达10-1210-9g最成熟的一类联用技术适用于小分子、易挥发、热稳定性好样品分析第八页，共一百一十页。二、GC-MS联用系统的构成气相色谱仪接口质谱仪离子源、质量分析器数据处理系统第九页，共一百一十页。出口气相色

3、谱仪高真空泵接口色谱工作站软件电脑离子源质量分析器机械泵检测器质谱仪第十页，共一百一十页。色谱单元与GC根本相同GC色谱条件： 色谱柱：毛细管柱 温度：气化室温度、柱温、检测器温度 载气？及流量：1ml/min第十一页，共一百一十页。GC-MS对载气选择的要求必须是化学惰性的必须不干扰质谱图必须不干扰总离子流的检测应具有使载气气流中的样品富集的某种特性 He第十二页，共一百一十页。GC-MS色谱柱的选择柱效好惰性好热稳定性好第十三页，共一百一十页。接口技术中要解决的问题气相色谱仪的大气压工作条件和质谱仪的真空工作条件的联接和匹配。作用：把气相色谱柱流出物中的载气尽可能多地除去，保存或浓缩待测物

4、，使近似大气压的气流转变成适合离子化装置的粗真空，并协调色谱仪和质谱仪的工作流量。 第十四页，共一百一十页。MS为什么需要真空提供足够的平均自由程提供无碰撞的离子轨道减少离子-分子反响减少背景干扰延长灯丝寿命消除放电增加灵敏度第十五页，共一百一十页。传输线、接口 MSD GC真空度： 10-5Torr 760Torr(常压)流速： 2ml/min 0.5-15ml/min传输线的要求：使GC和MS都到达最佳答案操作条件;保证被测组分可从GC传输到MS无不正常现象 (无灵敏度损失、无二次反响、无峰形改变)第十六页，共一百一十页。常用接口直接导入型：将毛细管色谱柱通过一根金属毛细管直接引入质谱仪的

5、离子源。适用于小口径毛细管柱。载气限于氦气或氢气，载气流量在0.71.0ml/min 开口分流型：气相色谱柱的一段插入接口，其出口正对着限流毛细管。限流毛细管承受将近0.1MPa的压力，与质谱仪的真空泵相匹配，将色谱柱流出物的一局部定量地引入质谱仪的离子源。适合于小径或中径毛细管柱。喷射式分子别离型浓缩型：填充柱和毛细管柱均适用第十七页，共一百一十页。气相色谱检测器热导检测器TCD氢火焰离子化检测器FID电子捕获检测器ECD火焰光度检测器FPD氮磷检测器NPD质谱检测器MSD第十八页，共一百一十页。GC检测器灵敏度比较pptrillionppbppmppthousandpercentTCDFI

6、DECDAEDPIDNPD (N)NPD (P)MSD(SIM)(SCAN)FPD (S)IRDELCDELCD(S or N)(X)10-15fg10-12pg10-9ng10-6mg10-3mg第十九页，共一百一十页。质谱检测器MSD样品被电子流轰击后产生离子这些离子按它们的质荷比m/z被别离后，测量其质量数和丰度值此检测器可以通过选择适当的质量而使其专一性好，选择性强。第二十页，共一百一十页。三、质谱检测器的组成离子源：提供样品能量，使样品分子电离生成气态分子离子或准分子离子，分子离子还可进一步裂解，产生各种碎片离子。用 70 ev 电子能量轰击的操作方式被称为电子电离质量分析器：将来自

7、离子源的不同质荷比离子离子的质量与其所带电荷的比值，m/z按空间位置或时间先后别离开的部件。 单重四级杆Q、三重四极杆QQQ、TQ检测器：用于接收、检测和记录被别离的离子信号。 高能打拿极和电子倍增器第二十一页，共一百一十页。质谱单元进样系统离子源质量分析器检测器控制和数据处理系统真空系统第二十二页，共一百一十页。离子源离子源的作用是将被分析的样品分子电离成带电的离子，并使这些离子在离子光学系统的作用下，会聚成有一定几何形状和一定能量的离子束，然后进入质量分析器被别离。第二十三页，共一百一十页。离子化技术EI电子轰击离子源CI化学离子源FAB快原子轰击离子化MALDI基质辅助激光解吸离子化FI

8、场致电离源ESI电喷雾电离源第二十四页，共一百一十页。EI电子轰击离子化V加速电压试样蒸汽阴极阳极电子束离子xyz电子轰击质谱示意图第二十五页，共一百一十页。Electron Impact Ionization电子轰击电离电子轰击。电子电离轰击电压50-70eV，有机分子的电离电位一般为7-15eV可提供丰富的结构信息有些化合物的分子离子不出现或很弱第二十六页，共一百一十页。第二十七页，共一百一十页。 优点：灵敏度高，有丰富的碎片离子信息和成熟的离子开裂理论，是结构分析、鉴定的有力手段；重现性好，有标准图谱，可以通过谱库检索对未知物进行结构鉴定 缺点：样品须汽化后才可离子化 适用化合物：易挥发

9、、热稳定化合物。 只检测正离子，不检测负离子 EI源的特点第二十八页，共一百一十页。化学离子化CI离子室内的反响气甲烷等；10-100Pa,样品的103-105倍，受电子100-240eV轰击，产生离子，再与试样别离碰撞，产生准分子离子。第二十九页，共一百一十页。如甲烷作为化学离子化反响气的电离过程CH4e CH4+2eCH4+ CH2+H2CH4+ CH3+HCH4+CH4 CH5+CH3CH3+CH4 C2H5+H2第三十页，共一百一十页。形成质子化分子离子M+H+MCH5+ M+H+CH4MC2H5+ M+H+C2H4第三十一页，共一百一十页。 软电离技术 优点：可以得到较强的准分子离子

10、峰，有利于分子量的测定；可检测负离子，灵敏度高。 缺点：样品须汽化后才可离子化 适用化合物：易挥发、热稳定化合物 无CI源标准谱图 CI的特点第三十二页，共一百一十页。四、质量分析器及质量别离原理四极杆质量分析器三重四极杆质量分析器离子阱质量分析器第三十三页，共一百一十页。第三十四页，共一百一十页。由四根截面呈双曲面的平行电极所组成，常常为圆柱形电极。离子的质量别离是在电极形成的电极场中完成的。四极电场由加在电极上的直流电压(U)和与之相叠加的射频电压(V)产生。在X方向电极上施加“UV电压，而在y方向上施加“-(UV)电压，而V=V0 cost，为射频频率，电极间的相对距离为2r第三十五页，

11、共一百一十页。四极杆质量分析器原理离子源中产生的不同质荷比m/z的离子从Z方向进入四极场，在射频电场的作用下，离子的运动方程为： 第三十六页，共一百一十页。离子的“a-q值处于该三角形内时，该离子的振幅是有限的，轨迹是稳定的，可通过四极场到达检测器离子的a-q值处于稳定三角形之外，其振幅随时间增大，其轨迹是不稳定的，这些离子将与电极碰撞消失 第三十七页，共一百一十页。选择适当的a/q值(U/V0值)，使扫描线通过稳定区，那么扫描线与稳定区二个交点之间对应的质量范围的离子可以沿Z方向到达检测器，而其他离子以不稳定振荡，与电极撞击而消失。当a/q值变为另一个值时，可使另一离子通过四极场-选择离子监

12、测SIM全扫描SCAN:保持U/V0值及不变，而改变U和V可以实现质量扫描。在给定的时间内不间断地对设定的质荷比(m/z)范围内的所有离子进行扫描。 如果提高扫描线的斜率，那么可提高质量分辨率，但灵敏度下降。如果降低扫描线的斜率，那么将降低分辨率。如果在极端状态，a0(U0)，四极杆质谱仅在射频方式(RF-only mode)下操作，那么所有m/z值的离子均具有稳定轨迹可通过四极区，这可用于串联质谱的碰撞室Q2。 第三十八页，共一百一十页。扫描类型：全扫描(full scan, SCAN)：用于未知化合物的定性分析。SCAN方式需要设置的参数有：扫描质荷比的起点和终点、CID电压等。扫描参数的

13、选择既要兼顾获得含尽量多的有效分子离子和碎片离子的质谱图，又要兼顾获得好的总离子流图。选择离子监测(selected ion monitoring，SIM)：用于定量分析，常用于目标化合物的检测和在数量众多的样品中快速筛选目标化合物。与SCAN方式相比，SIM方式能到达更低的检测限、更快的速度、更好的灵敏度和更短的分析时间，适用于定量分析。但选择SIM方式不利于定性分析。第三十九页，共一百一十页。四极杆质量分析器quadrupole，QM1M2M3检测模式全扫描Full Scan选择离子检测SIM分辨率：低第四十页，共一百一十页。单四极杆特点四极杆质量分析器是GC-MS联用仪中最通用的一种质量

14、分析器有全扫描(Scan)和选择离监测(SIM)两种不同扫描模式扫描速度快,灵敏度高，尤其是SIM模式可在较低的真空度下工作分辨率较低，不能提供亚稳离子信息结构简单、体积小、自动化程度高第四十一页，共一百一十页。三重四极杆质谱仪QQQM+H+Q1质量分析器Q3质量分析器Q2 碰撞室活化室.串联质谱MS/MS低分辨第四十二页，共一百一十页。QQQ特点离子、母离子、中性丧失三种扫描方式母离子找子离子获得碎片离子子离子找母离子获得前体离子中性基因相关质量的离子，确定各离子归属，研究离子的碎裂途径，用于化合物的结构分析第四十三页，共一百一十页。离子阱质量分析器ion trap，IT离子注入质量选择推出

15、检测模式全扫描Full Scan选择离子检测SIM分辨率：低第四十四页，共一百一十页。离子阱质量分析器示意图 由三个电极组成的三维四极场处在端电极中心的小孔是离子进出阱的通道。一定固有频率的射频电压施加于环电极上，在环电极和端电极之间有高频电势差，形成了一个四极场。 RF值是指施加在环电极和两个端电极之间的电压，依靠具不同水平的RF值的四极场，离子阱可以在一个特定的质量范围内俘获并稳定一定数量的离子。 第四十五页，共一百一十页。IT原理与四极杆质量分析器相似，离子在离子阱中的运动也有稳定和不稳定两种情况。处于稳定区的离子，运动幅度不大，能长期存储在离子阱中。处于稳定区之外的离子，由于幅度过大，

16、会与环电极或端电极相撞而消亡。 第四十六页，共一百一十页。质谱过程 离子被充入离子阱: 通过降低施加在锥形别离器的排斥电压，让离子束通过来实现的。进入阱内的离子被施加了低于四极振幅的射频场俘获。设置好一定的积累时间，锥形别离器的排斥电压升高，以阻止后续离子进入阱内。累积的离子通过与阱内浴气(He)碰撞而冷却。以确保离子云驻留于阱中心一定的空间范围内。扫描开始，四极和二级的势场增加，离子按质量增加的顺序通过出口端帽被逐出离子阱。扫描结束后，四极场降低到零以去除残留在阱内的离子。阱回到初始状态，锥形别离器设置为允许离子进入并累积的初始状态，新的循环开始。 第四十七页，共一百一十页。IT特点时间上串

17、联的质量分析器，只需一个离子阱质量分析器即可实现多级串联质谱，本钱低、价格廉价离子阱质量分析器的灵敏度高，离子损失小-离子利用率高；离子阱质量分析器的质量范围大第四十八页，共一百一十页。扫描方式可实现二次或屡次质谱MSn分析全扫描模式SCAN：主要对未知化合物做定性分析选择离子扫描模式SIM：主要应用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析SIM较SCAN有更高的灵敏度，峰型较好，排除干扰，提高信噪比，适合定量分析第四十九页，共一百一十页。四、GC-MS主要信息总流子流色谱图(TIC，total ion current):样品随载气进入质谱检测器中，在不同时间点得到的离子总信号的响应图，称

18、为总离子流图。可用于了解样品的质谱全貌 质谱图(MS，mass specturm):一个纯粹化合物经离子化、裂解形成一系列离子的质荷比与强度的分布图。 质量色谱图-提取离子流色谱图(extracted ion chromatography)选择离子监测技术(SIM)谱库检索第五十页，共一百一十页。总离子流色谱图第五十一页，共一百一十页。甲苯的EI质谱图 第五十二页，共一百一十页。质谱峰的类型 分子离子(molecular ion, M+)峰:分子失去一个电子生成的离子称为分子离子，通常以M+表示，分子离子形成的峰称为分子离子峰。准分子离子(qauasi molecular ion)峰：软电离质

19、谱可检测到化合物分子得到或失去某一离子而形成的离子称为准分子离子。如分子通常得到或失去一个氢离子形成的M+H+、M-H-准分子离子，常见的准分子离子还有M+Na+、M+K+等离子第五十三页，共一百一十页。质谱峰的类型同位素离子(isotopic ion)峰：含元素的重同位素构成的离子称同位素离子，同位素离子形成的峰称同位素峰，在质谱图中同位素峰出现在相应的分子离子或碎片离子峰的右侧高质荷比侧，如 M+1+、M+2+峰。碎片离子fragment ion：由分子离子或准分子离子继续裂解而生成的产物离子。多电荷离子、亚稳离子等产生的峰。 第五十四页，共一百一十页。提取离子流色谱图第五十五页，共一百一

20、十页。提取离子色谱图用途利用质量色谱图法搜寻目标化合物，以快速鉴别化合物类型可以检查色谱峰的纯度比总离子流图简洁，消除了背景干扰第五十六页，共一百一十页。全扫描SCAN 主要对未知化合物做定性分析选择离子检测SIM 主要应用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析质谱扫描技术第五十七页，共一百一十页。第五十八页，共一百一十页。选择离子监测SIM第五十九页，共一百一十页。第六十页，共一百一十页。第六十一页，共一百一十页。第六十二页，共一百一十页。谱库检索-NIST05谱图检索注意的问题1、首先简化和筛选谱图，然后比较，计算相似系数，按匹配率排序输出。2、检索结果分析 相似系数判别-匹配率大于

21、90%结果可靠性大，小于60%可靠性较差。第六十三页，共一百一十页。GC-MS联用仪器主要性能指标一、气相色谱仪的性能指标 1、进样系统 分流/不分流进样口 2、柱系统 DB-5MS HP-5MS DB-225MS 3、检测系统 FID ECD MS第六十四页，共一百一十页。质谱仪的主要性能指标1、质量范围 1-1200u 2、准确度 质量准确度0.1u，给出整数质量，低分辨。3、分辨率 1000-20004、扫描速度 4000-6000u/s第六十五页，共一百一十页。五、GC-MS的操作第六十六页，共一百一十页。第六十七页，共一百一十页。第六十八页，共一百一十页。第六十九页，共一百一十页。第

22、七十页，共一百一十页。第七十一页，共一百一十页。第七十二页，共一百一十页。第七十三页，共一百一十页。第七十四页，共一百一十页。质谱参数第七十五页，共一百一十页。第七十六页，共一百一十页。选择离子检测参数第七十七页，共一百一十页。定性、定量分析定性分析：谱库检索完成定量分析：与GC相同第七十八页，共一百一十页。定性分析荆芥油样品第七十九页，共一百一十页。谱库检索分析第八十页，共一百一十页。定性分析黄酒样品第八十一页，共一百一十页。谱库检索分析第八十二页，共一百一十页。定量分析样品第八十三页，共一百一十页。定量分析对照品第八十四页，共一百一十页。对样品的要求1、沸点范围宽、化合物性质差异大的样品，

23、需要进行预处理。尤其是石油类样品。2、难挥发、热不稳定、有极性基团的化合物需要衍生化处理。有机酸类物质。3、缺少样品信息，假设有条件最好先用气相色谱分析。4、样品进样前需要高速离心，取上层清液进样。第八十五页，共一百一十页。六、GC-MS的应用 1、石油中烃类、非烃类单体化合物分析 2、化工原料组成分析 3、酒类产品中醇、醛、酸、酯类化合物分析 4、香精香料分析 5、烟草成分分析 6、药物分析：常用于挥发油成分的鉴别、甾体药物的分析、中药材中农药残留监测、药物代谢的研究等方面 7、环境分析：有机污染物等第八十六页，共一百一十页。在定性鉴别的应用 在药物定性鉴别中，GC-MS主要用于药物中杂质的

24、鉴别、药物合成反响历程监控、运发动体内兴奋剂检测、药物的体内代谢物的鉴别等方面，但GC-MS法对样品的极性、挥发性和热稳定性有一定的要求。在中药定性分析中，GC-MS主要用于中药挥发性成分的定性分析、中药材和中药制剂中残留有机溶剂的定性等。第八十七页，共一百一十页。第八十八页，共一百一十页。第八十九页，共一百一十页。第九十页，共一百一十页。第九十一页，共一百一十页。第九十二页，共一百一十页。第九十三页，共一百一十页。巴豆油化学成分的 GC- MS 分析巴豆油的甲酯化 称取巴豆油样参加 0.5mol /L KOH- CH3OH 溶液 60 水浴皂化 40min(油珠完全消失) ，冷却后加水摇匀，

25、移至分液漏斗，以每次20 mL 乙醚萃取3 次，合并萃取液，加无水硫酸钠枯燥，回收乙醚得样品巴豆油甲酯化或用乙醚稀释后经气相色谱石英毛细管柱别离， 质谱仪记录质谱图，得到 GC- MS 总离子流图第九十四页，共一百一十页。GC-MS条件色谱条件: 色谱柱为 DB- FFAP ( 30 m 0. 25 mm 0. 25 m) 毛细管柱，柱温100 ，以10 /min 程序升温至220 ，保持18 min 进样口温度250 ，载气 He，柱前压 75 kPa，分流比 10 1，进样量0. 5 L质谱条件: EI 离子源，电子能量 70 eV，扫描范围 m/ z 29 450 amu，四极杆温度15

26、0 ，离子源温度230 ，电子倍增器电压 1 500 V， GC- MS 接口温度280 ， 标准质谱图库 Wiley 275. L第九十五页，共一百一十页。巴豆油甲酯化的TIC第九十六页，共一百一十页。鉴定出的16 种脂肪酸成分中亚油酸最高， 相对含量占44.36%。其次是油酸( 18.48%) 、 二十碳一烯酸( 14.49 )第九十七页，共一百一十页。SPME/GC-MS 鉴别地沟油新方法采用固相微萃取( SPME) 气相色- 质谱联用( GC-MS) 技术，研究油脂内源及外源物质的微量化学成分纯粹花生油和大豆油不含反式脂肪酸，地沟油含有反式脂肪酸 trans- C18:1 、trans

27、-C18:2;纯粹花生油和大豆油中含有正己醛、正壬醛和正癸醛等杂质，而地沟油中除了这几种醛类外，还含有乙酸、 3-丁烯腈、 2，5-二甲基吡嗪等特征杂质成分通过测定内源性物质和外源性物质的存在，两种检测结果互相印证，综合判断，最终可确定是否为地沟油第九十八页，共一百一十页。固相微萃取(SPME)将10. 0 g 地沟油装入20 mL 带有聚四氟乙烯密封塞的顶空瓶中，密封，将带有NACC 专用萃取头的固相微萃取针穿过密封塞插入顶空瓶中，推出 NACC 萃取头( 萃取头距样品外表约1 cm) ，于室温下萃取30 min 后，取出固相微萃取针迅速插入气相色谱进样口中，在240 下解吸10 min，G

28、C MS 测定微量杂质成分第九十九页，共一百一十页。甲酯化衍生化按文献方法将脂肪甘油酯转化为脂肪酸甲酯：称取约0.1 g 脂肪，置于10 mL 量瓶中，参加1 mL 乙醚 正己烷( 1 1，体积比) ，摇匀，然后参加 1 mL 无水甲醇，摇匀，再参加1 mL 0. 8 mol /L KOH -甲醇溶液，摇动 5min，加水至刻度，静置分层，取上层液进行GC-MS测定反式脂肪酸第一百页，共一百一十页。GC-MS 分析GC条件1(用于 SPME 测定) 色谱柱: AB- 5MS( 30 m 0. 25 mm 0. 25 m) 弹性石英毛细管柱; 载气: He( 99. 999%) ; 恒流，柱流量

29、: 0. 7 mL /min; 分流进样，分流比: 10 1; 进样量: 1. 0L; 进样口温度: 240 ; 柱始温140 ，保存2 min，以8 /min 程序升温至280 第一百零一页，共一百一十页。GC 条件2(用于脂肪酸测定) 色谱柱: HP- 88( 100 m 0. 25 mm 0. 2 m) 弹性石英毛细管柱 柱温170 ，恒温2 min，以10 /min 程序升温至200 ，保持32 min 进样口温度250 载气 He，柱前压265 kPa 分流进样，分流比10 1，进样量0. 5 LMS 条件 离子源: EI 源; 离子源温度: 230 ; 四极杆温度: 150 ; 色谱 质谱连接口温度: 280 ; 电子能量: 70 eV; 电子倍增器电压 1 500 V; 固相微萃取的解吸时间为 10 min; 扫描方式: SCAN，扫描范围29 450 u第一百零二