益气化淤中药对大鼠胃癌前病变蛋白激酶C蛋白表达的影响

1、益气化淤中药对大鼠胃癌前病变蛋白激酶C蛋白表达的影响【摘要】目的观察益气化淤中药对大鼠胃癌前病变胃黏膜蛋白激酶PK表达的影响。方法采用NNG、乙醇、饥饱失常等多因素造模。造模型成功后，将造模存活大鼠随机分为自然恢复组，中药高、中、低剂量组,各组大鼠作相应的处理后,免疫组化法检测各组大鼠胃黏膜组织PK表达程度。结果各治疗组PK表达较自然恢复组下调,有显著性差异(P0.05)。结论益气化瘀中药可能是下调PK的表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，而发挥对大鼠胃癌前病变的治疗作用。【关键词】胃癌前病变蛋白激酶益气化淤中药Abstrat：bjetiveTbservetheeffetfYiqiHuayuRe

2、ipentheexpressinfprtEinkinase(PK)inratsithgastripreaneruslesins(GPL).ethdsThedelfGPLasestablishedainlythrughN-ethyl-N-nitrN-nitrsguanidine(NNG)tgetheriththerfatrsinludingalhlstiulatinandunduehungerandvereating.Thesurvivedratsafterdelingererandlydividedintspntaneusrevery,andhigh-,derate-andl-dsefYiqi

3、HuayuReipegrup.Aftertherrespndingtreatent,theexpressinfPKasdetetedbyiunhistheialethd.ResultsTheexpressinfPKineahtreatentgruperedistintlylerthanthatinspntaneusreverygrup(P0.05).nlusinYiqiHuayuReipeiseffetiveinthetreatentfratsithGPLbyinhibitingtheexpressinfPK.Keyrds：Gastripreaneruslesins;Prteinkinase;

4、YiqiHuayuReipe慢性萎缩性胃炎AG伴中重度不典型增生或/和不完全性结肠型化生是胃癌的重要癌前病变。益气化淤中药临床治疗胃癌前病变获得了很好的治疗效果1，为了讨论其作用机制，特设计本实验，现报道如下。1材料与方法1.1药物及试剂甲硝基亚硝基胍(NNG)为Fluka公司产品，每周用双蒸水配成1g/L的母液4避光储存，临用时用双蒸水配成所需浓度；脱氧胆酸钠购自湖北省医药公司；雷尼替丁由杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药消费；PK小鼠抗大鼠单克隆抗体为SantaGruz公司产品；生物素化山羊抗小鼠IgG(二抗)、辣根酶标记链亲合素(三抗)、DAB、封闭用山羊血清等为博士德试剂公司产品。益气化淤中药

5、主要由太子参、石斛、三七、郁金、白花蛇舌草等组成，浓度2gl。1.2造模及给药方法选用SPF级6周龄SD大鼠62只，体质量100120g。造模参照严茂祥等26综合造模方法并加以改良。大鼠自购进后适应性喂养1d。从62只大鼠中随机抽取13只作为正常组,其余49只用于造模。正常组大鼠不做任何处理；造模大鼠每日自由饮用100g/LNNG液(饮料瓶用油漆涂黑避光)、进食含0.3g/L雷尼替丁的纯鼠饲料、上午用56150g/L的氯化钠液按10l/kg灌胃，进食2d，禁食1d，进食当天下午用8.5g/L脱氧胆酸钠溶液按10l/kg灌胃。禁食当天下午用400l/L乙醇按10l/kg灌胃，连续24周。24周末

6、时随机抽取正常组和造模大鼠各1只，杀检，观察组织病理学变化(以HE染色光学显微镜下观察的结果为主)，确认模型是否成功。造模型成功后，将造模存活的48只大鼠随机分为自然恢复组12只。中药高、中、低剂量组(简称高、中、低剂量组)各12只。高剂量组每日每只按20g/kg(相当于成人1d用量的两倍)灌胃，中剂量组按10g/kg(相当于成人1d用量)灌胃，低剂量组按5g/kg(相当于成人1d用量的50%)灌胃。上述治疗16周。自然恢复组同正常组大鼠常规饮食。40周末所有动物禁食1d，处死，剖腹取胃，沿胃大弯剪开，生理盐水冲洗，肉眼观察，平铺于硬纸板上，于胃窦部剪取组织1块，40g/L多聚甲醛固定，石蜡包

7、埋,切片5,免疫组织化学染色。1.3PK蛋白表达PK一抗稀释倍数(1100)，染色步骤如下:切片脱蜡入水。3%H22室温孵育1in,以灭活内源性酶。最后蒸馏水洗3次。将切片浸入TAB(0.05l/L，pH7.4)中,电炉加热至100,持续30in。冷却后进展下一步。滴加抗原修复液,室温孵育10in，蒸馏水洗3次。滴加正常5%山羊血清封闭液,室温孵育10in，甩去多余液体。滴加稀释的一抗,4湿盒内过夜。TAB洗涤3次,每次5in,滴加二抗室温孵育30in。TAB洗涤3次，5in/次，滴加三抗(HIGH-SAB)室温孵育30in。TAB洗涤3次，5in/次，DAB显色。自来水冲洗，苏木复染，封片。

8、1.4观察方法及判断标准根据文献7加以改良。切片中出现黄染为阳性。每张切片由两位观察者独立计数,随机取染色区域4个高倍视野(400)阳性细胞平均数,用半定量计分。染色强度用03级计分：0级为无染色；1级为轻度阳性染色；2级为中度阳性染色；3级为强阳性染色；染色范围根据细胞阳性染色的百分数而分为04级：0级为无染色；1级为510细胞染色；2级为1020细胞染色；3级为2050细胞染色；4级为50细胞染色。染色总评分为染色强度+染色范围。1.5统计学处理方法数据用s表示,组间差异性比拟采用q检验，P0.05认为有显著性差异。2结果PK在正常组中主要存在于胞浆,其他组别中,除了胞浆外，在胞膜和胞核也

9、可见。自然恢复组较对照组PK表达增强,有非常显著性差异(P0.01)；各治疗组较对照组PK表达增强,但没有显著性差异(P0.05)；各治疗组较自然恢复组PK表达下调,有显著性差异(P0.05)；各治疗组之间比拟没有显著性差异(P0.05)。结果见表1。表1各组大鼠的PK蛋白表达(略)3讨论蛋白激酶(PK)是1977年由日本学者Nishizuka等8首次在鼠脑的胞质成分中发现的一种依赖磷脂和钙的蛋白激酶,其广泛分布于真核细胞中,由多种具有不同生物学特性的同工酶组成,是细胞内信号传导的重要递质。PK通常处于失活状态,被激活后可由细胞质转位到细胞膜,可以使众多蛋白质中的丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化而发挥

10、作用。PK的活化不仅与正常细胞和异常细胞的生长、分化、凋亡等多种生物学效应有关，更在肿瘤的发生、开展、转移和多药耐药等方面发挥重要作用。有人采用不同浓度的PK抑制剂Staursprine(ST)作用于人胃癌细胞株G803和SG7901后,细胞增殖受到明显抑制,说明PK在胃癌细胞增殖中具有重要作用9。胃癌细胞增殖时,PK活性表现为上调趋势,而诱导胃癌细胞凋亡时,它表现为下调趋势1012，一些化疗药物和抑制增殖及诱导凋亡的药物如特异性环氧化酶2抑制剂也通过下调PK活性而抑制胃癌细胞生长13，14。本实验结果说明，以NNG为主的多因素结合攻击法诱发的大鼠胃癌前病变(自然恢复组)粘膜PK蛋白表达明显增

11、高，胃炎消能使PK蛋白表达明显下降(与自然恢复组比拟，P0.05)，我们推测胃炎消可能是通过下调PK的表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，而发挥对大鼠胃癌前病变的治疗作用。【参考文献】1胡玲，黄志新.劳绍贤医学文选.广州：广东科技出版社，2022：201.2严茂祥,陈芝芸,项柏康,等.大鼠胃黏膜癌前病变模型的建立J.浙江中医学院学报，1998,22:3.3李春启,刘为纹,房殿春.甲硝亚硝胍和/或雷尼替丁诱发大鼠腺胃黏膜肠上皮化生J.胃肠病学和肝病学杂志，1995，4410邢承忠,陈峻青.胃癌细胞凋亡过程中PK活性表达的变化J.中国医科大学学报,1999,28(1):25.11UhidaN,kauraS,KuanH.PrteinkinaseativityinhuangastriarinaJ.nlRep,2000,7(4):793.12Izaa,TeraahiK.Dn-regulatinfprteinkinaseativitybysrbitlrapidlyinduesapptsisinhuangastrianerelllinesJ.Apptsis,2001,6(5):353.13JiangXH,LaSK,Lin,etal.Nveltargetfrindutinfapptsisbyyl-xygenase-2inhibitrS2236thrughaprteinkinasebeta(1)de