一枝黄花的遗传毒性研究教学文案

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。一枝黄花的遗传毒性研究序号：编码：湖北省第九届“挑战杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品作品名称：一枝黄花的遗传毒性研究类别：自然科学类学术论文哲学社会科学类社会调查报告和学术论文科技发明制作A类科技发明制作B类目录TOCo1-3hzuHYPERLINKl_Toc354746152摘要PAGEREF_Toc354746152h1HYPERLINKl_Toc3547461531、前言PAGEREF_Toc354746153h3HYPERLINKl_Toc3547461542、研究方法PAGEREF_To

2、c354746154h4HYPERLINKl_Toc3547461552.1实验材料PAGEREF_Toc354746155h4HYPERLINKl_Toc3547461562.2实验器材PAGEREF_Toc354746156h4HYPERLINKl_Toc3547461572.3实验步骤PAGEREF_Toc354746157h4HYPERLINKl_Toc3547461582.3.1一枝黄花浸提液的制备PAGEREF_Toc354746158h4HYPERLINKl_Toc3547461592.3.2蚕豆材料的选择、消毒与浸种催芽PAGEREF_Toc354746159h5HYPERLI

3、NKl_Toc3547461602.3.3处理PAGEREF_Toc354746160h5HYPERLINKl_Toc3547461612.3.4根尖恢复培养PAGEREF_Toc354746161h5HYPERLINKl_Toc3547461622.3.5固定细胞根尖PAGEREF_Toc354746162h5HYPERLINKl_Toc3547461632.3.6制片PAGEREF_Toc354746163h6HYPERLINKl_Toc3547461642.3.7镜检及计数PAGEREF_Toc354746164h6HYPERLINKl_Toc3547461652.3.8统计学处理PAG

4、EREF_Toc354746165h7HYPERLINKl_Toc3547461662.4操作要点PAGEREF_Toc354746166h7HYPERLINKl_Toc3547461672.4.1配制试剂PAGEREF_Toc354746167h7HYPERLINKl_Toc3547461682.4.2萌发处理PAGEREF_Toc354746168h7HYPERLINKl_Toc3547461692.4.3诱导PAGEREF_Toc354746169h7HYPERLINKl_Toc3547461702.4.4恢复培养PAGEREF_Toc354746170h7HYPERLINKl_Toc3

5、547461713、实验结果PAGEREF_Toc354746171h8HYPERLINKl_Toc3547461723.1一枝黄花浸提液对蚕豆根尖细胞有丝分裂的影响PAGEREF_Toc354746172h8HYPERLINKl_Toc3547461733.2一枝黄花浸提液对蚕豆根尖细胞微核率的影响PAGEREF_Toc354746173h9HYPERLINKl_Toc3547461743.3一枝黄花浸提液对蚕豆根尖细胞染色体畸变的影响PAGEREF_Toc354746174h10HYPERLINKl_Toc3547461754、讨论分析PAGEREF_Toc354746175h11HYPE

6、RLINKl_Toc3547461765、结语PAGEREF_Toc354746176h12HYPERLINKl_Toc354746177参考文献：PAGEREF_Toc354746177h12HYPERLINKl_Toc354746178附件：科技查新报告PAGEREF_Toc354746178h14一枝黄花的遗传毒性研究董亚娟方舟摘要：一枝黄花（Solidagodecurrens）为菊科（Asteraceae）一枝黄花属植物，主产于我国南方。是一种应用非常广泛的切花材料，因它与众所周知的恶性杂草加拿大一枝黄花（Solidagocanadensis）同为一枝黄花属植物，所以对其应用的生态安全

7、性一直存在较大争论。本文以市售一枝黄花为实验材料，运用蚕豆根尖微核技术研究一枝黄花水浸提液的化感作用，旨在分析一枝黄花的遗传毒性。结果表明：（1）一枝黄花水浸提液使有丝分裂指数下降，干扰了细胞有丝分裂的正常进行，下降幅度与水浸提液浓度和处理时间呈正相关；（2）一枝黄花水浸提液使蚕豆根尖的微核率升高，上升幅度与水浸提液浓度和处理时间呈正相关；（3）一枝黄花水浸提液使蚕豆根尖细胞出现染色体桥、染色体断片、染色体滞后等异常现象，且水浸提液对蚕豆根尖的影响存在显著地时间效应和浓度效应。上述结果表明一枝黄花水浸提液对蚕豆根尖细胞有丝分裂产生不同程度的抑制和损伤，具有一定的遗传毒性，具备快速扩散的能力。关

8、键词：一枝黄花；遗传毒性；蚕豆根尖；微核StudyonGeneticToxicityofSolidagodecurrensDONGYa-juanFANGZhouAbstract:SolidagodecurrensbelongstotheSolidagoofAsteraceae,mainlydistributedinsouthernChina.Isaveryextensiveapplicationofflowerarrangementmaterial,becauseitisaseveryoneknowsandmalignantweedSolidagocanadensisthesameasgenu

9、s,sotheecologicalsecurityoftheapplicationhasbeengreatcontroversy.Inthispaper,usingcommercialSolidagodecurrensasexperimentalmaterial,usingmicronucleustesttechniqueinViciafabarootstudyonalelopathyeffectsofSolidagodecurrensofwaterextract,aimstoanalyzethegenetictoxicityofSolidagodecurrens.Theresultsshow

10、that:(1)Solidagodecurrensofwaterextractmadethemitoticindexdecreased,interferewiththecellmitosisnormally,dropandwaterleachingsolutionconcentrationandtreatmenttimewerepositivelyrelated;(2)SolidagodecurrensofwaterextractmadetheViciafabarootmicronucleusraterising,risingamplitudewasapositivecorrelationbe

11、tweenwaterextractconcentrationandtreatmenttime;(3)SolidagodecurrensofwaterextractmadetheViciafabarootappearedchromosomebridge,chromosomefragment,frequencyoflaggingchromosomesandtheotherabnormalphenomena,theeffectsofwaterextractonViciafabaroottipofthesignificanttimeeffectandconcentrationeffect.Theres

12、ultsshowthatSolidagodecurrensofwaterextracthasadifferentdegreesinhibitionandinjuryofViciafabaroottipcellsmitosis,andhasacertaingenetictoxicity,withtherapiddiffusion.Keywords:Solidagodecurrens;Genetictoxicity;Viciafabaroottip;micronucleus1、前言一枝黄花(SoIidagodecurrensLour)系菊科(Asteraceae)一枝黄花属多年生草本植物，主要生长

13、于我国的华东、中南、西南及陕西、台湾等地。一枝黄花的种子非常细小，种子上长有多根细毛，像蒲公英种子一样随风飘散，传播极广，种子入土后即萌生新的植株，结籽后老植株枯萎，在其蓿根四周长出几十根幼枝，到下一年又开花结籽。近年来，国内外关于一枝黄花的研究的相关报道主要集中在一枝黄花的相关的化学成分1-2、物理化学分析3、药用成分及药理作用4、化感作用5-6等方面。研究方法也各不相同。自然界的植物中含有丰富的萜类物质，植物释放出的萜类化合物会对其它植物产生化感作用已被证实。已知加拿大一枝黄花的精油中含有丰富的单萜类、倍半萜烯类、单萜含氧化物、倍半萜含氧化物等成分7。外来植物成功入侵的原因是多方面的，其中

14、化感作用在植物入侵过程中起着非常重要的作用8，化感物质能显著的影响植物细胞生长和分化9，目前，化感作用研究使用的生物测定方法很多，缺乏一定的标准，甚至同一实验室的研究报道使用的生物测定方法也不相同，以致不同化感作用研究结果之间很难加以比较。近年来国内化感作用研究日趋增多，研究者迫切需要更多了解国内外的生物测定方法以及这些方法的适应性。选择适当的生物测定方法是化感作用研究的关键之一10。蚕豆（Viciafaba）根尖微核技术自1982年由Degressi等建立以来，以其简单、快速等特点，广泛用于对水源、土壤、大气等环境中化学有毒物质和环境污染物的致突变性检测。早在1986年国家环境保护总局就将蚕

15、豆根尖微核检测技术列入了环境监测技术规范用于水环境监测技术。目前，关于遗传毒性的研究的几个指标有有丝分裂指数、微核率、染色体畸变等，如陈丽萍11等、杜凤移12等、周晓奎13等、范雪涛14等均采用上述指标对外来入侵植物的遗传毒性进行了测定。高沛业，谢焕松，周鸣鸣15通过蚕豆微核技术评价卷丹的安全性，为其综合利用提供依据。而田玉玲，李淑红，刘冰，刘利，崔黎明16采用小鼠骨髓细胞微核试验(MNT)法探讨了胡桃楸水提物(Juglansmandshuricamaximextract,JMME)的抗诱变作用，评价胡桃楸是否具有遗传毒性。一枝黄花是一种应用非常广泛的切花材料，因它与众所周知的恶性杂草加拿大一

16、枝黄花（SolidagocanadensisL.）同为一枝黄花属植物，所以对其应用的生态安全性一直存在较大争论。为了科学合理地利用一枝黄花，有必要对该植物的遗传毒性深入广泛研究。2、研究方法2.1实验材料市售蚕豆种子、市售一枝黄花。蒸馏水、卡诺氏固定液（无水乙醇：冰醋酸=3：1）、改良苯酚品红溶液、70%乙醇、1mol/L盐酸、0.5%KMnO4溶液。2.2实验器材显微镜、载玻片、盖玻片、培养皿、滤纸、镊子、解剖针、恒温培养箱、剪刀、量筒、白磁盘、纱布、水浴锅、烘箱、标签纸2.3实验步骤2.3.1一枝黄花浸提液的制备取生长健壮的市售一枝黄花的新鲜茎叶，先用清水冲洗后晾干，再用剪刀将其剪碎，称其

17、重量后各放入锥形瓶，按1g鲜重材料4mL的清水的比例置于锥形瓶中，间歇振荡(23oC)浸提，48h后倒出浸提液，用三层干净的纱布过滤得到浸提原液(浓度为0.25g/mL)，将浸提原液分别用蒸馏水稀释成0.025g/mL、0.050g/mL、0.075g/mL、0.100g/mL放入冰箱中待用11-16。2.3.2蚕豆材料的选择、消毒与浸种催芽依据国家环保总局水和废水监测分析方法中“蚕豆根尖微核试验”的方法并略加改进。挑选饱满、大小均匀、无损伤的蚕豆种子，自来水洗净后用0.5%KMnO4消毒30min，蒸馏水冲洗3-5次。将实清洗好的蚕豆种子按需要量放入盛有蒸馏水的烧杯中，在23oC下浸泡24小

18、时，此间至少换水两次（所换水应23oC预温）。种子吸胀后；用纱布松散包裹置白磁盘中，保持湿度，在23oC温箱中催芽12-24小时（无光培养），待初生根长出2-3mm时，再取发芽良好的种子，放入铺满滤纸的白磁盘中，23oC继续催芽，经约36-48小时17。选择根长一致初生根长1-2cm左右，根毛发育良好的蚕豆随机分成5组，每个白瓷盘40-50粒。2.3.3处理分别用0.025g/mL、0.05g/mL、0.075g/mL、0.1g/mL的一枝黄花浸提液40mL处理根尖，同时，取另一个培养皿以蒸馏水处理根尖，作为对照。每一处理选取10-15粒，分别处理24h、48h、72h11-16(在23oC，

19、80%湿度、14h/d光照的条件下连续培养3d)。2.3.4根尖恢复培养每隔24h从每个处理中抽出10颗蚕豆种子，用蒸馏水浸洗3次，每次3min，然后移至23oC恒温箱中恢复培养24h。2.3.5固定细胞根尖将恢复后的种子从根尖顶端切下1-1.5cm长的幼根放入广口瓶中，以卡诺氏固定液进行固定2-24小时后，保存于70%乙醇溶液中，于4oC冰箱中保存。固定是为了迅速杀死细胞并使细胞核、细胞器在形态结构上尽可能保持生活时完整、真实状态，使细胞永久处于分裂周期中的某个时期。传统做法是放人卡诺氏液中，此液多用于细胞学制片，尤适用于固定染色体、中心体、DNA和RNA等，固定后适合各种染色。本实验中固定

20、液兼有防止乙醇硬化及收缩作用并增加渗透力。2.3.6制片水洗：用蒸馏水清洗幼根2-3min。水洗吸取残留在根尖的卡诺氏固定。酸解：加入1mol/L盐酸浸没幼根60oC水浴10min，使幼根软化。解离是溶解细胞之间的果胶层使细胞彼此分离，压片时细胞容易分散，并保持细胞原有形状。实验中我们观察到准确把握解离时间很重要，首先一定要充分解离，不然易形成组织块无论染色还是制片效果都不好；但解离时间又不宜过长，否则会使细胞结构破坏，无法观察分裂项。解离标准以材料酥软细胞易于分散为准，解离时间以3-5min为宜，也应根据解离液浓度、环境温度等不同而有所差异。水洗：解离前后用蒸馏水清洗干净。实验要求解离后漂洗

21、根尖，目的是洗去酸液，避免与碱性染料发生中和反应，利于染色体着色。染色及压片：截取12mm长的根尖置载玻片上，用刀片纵切成两分，滴一滴染液，染色58min，加上盖玻片，压片。染色是使细胞质、染色体分别染上深浅不一的颜色，便清晰地观察染色体行为。压片则是盖上盖玻片，用一滤纸片压住盖片的两角，在平坦桌面上用铅笔上的橡皮头对准盖玻片下材料从中部向四周轻轻敲打，使材料离散成均匀的细雾状，避免将材料碾碎或造成细胞堆积不均，影响观察。2.3.7镜检及计数常规制片后，将玻片标本放在显微镜的低倍镜下观察，找到分生组织区细胞分散良好、核膨大、分裂相多的部分，转到高倍镜下进行观察。并根据识别标准进行计数与拍照。若

22、染色体分散不均而难以分辨和计数，可取下片子，平放桌面上，用手指隔着吸水纸在盖玻片上稍施压力，如果操作细心，用力适度，便可容易得到染色分散良好的压片标本，供观察、计数和照相用。化感效应敏感指数(RI)计算方法参照Williamson18等的方法：RI=1-C/T，式中，C为对照值。T为处理值，RI为化感作用效应(RI0为促进，RI0为抑制，绝对值的大小与作用强度一致)。2.3.8统计学处理对所得的数据进行Duncans检验。2.4操作要点2.4.1配制试剂对于有毒试剂配制时应当戴一次性塑料手套，将配好的溶液置于4C冰箱内保存，配制完后要洗手。2.4.2萌发处理蚕豆种子萌发需要温暖湿润的条件，在种

23、子发芽期间要注意保湿保温，但又不能将种子完全浸没，否则会影响其呼吸作用，所以在草纸干时，应加少量水至草纸出现水光即可。2.4.3诱导浸提液对植物的根起作用，所以要浸没根尖，才会达到更好的效果。另外，处理时间要准确，过长会使根尖微核率增加，从而产生误差。2.4.4恢复培养蚕豆根尖细胞经诱变剂处理后，发生DNA损伤，但如果有些细胞不分裂的话，还是保持原来的单细胞核状态，也就是说并不形成微核。只有经恢复培养后，经有丝分裂，DNA损伤得以表现出来，而这种表现就是微核的形成。所以必须经过恢复培养。已经处理完的蚕豆必须将其上的一枝黄花浸提液洗净，所以最好将其用纱网布包好，用蒸馏水洗即可。然后放置到23oC

24、恒温箱中培养，效果会更明显。3、实验结果3.1一枝黄花浸提液对蚕豆根尖细胞有丝分裂的影响一枝黄花水浸提液对蚕豆根尖细胞有丝分裂指数的影响见表1、图1。表1.一枝黄花浸提液对蚕豆根尖有丝分裂的影响Table1.TheeffectofaqueousextractsofSoIidagodecurrensLouronmitosesofviciafabaroottipcells水浸提液浓度（g/mL）concentrationofaqueousextracts24h48h72h有丝分裂指数%mitoticindexRI有丝分裂指数%mitoticindexRI有丝分裂指数%mitoticindexRI0

25、.0000.0250.0500.0750.1009.466.20*6.04*5.44*2.56*-0.526-0.566-0.739-2.6957.186.32*6.08*4.58*2.36*-0.136-0.181-0.568-2.0424.525.64*5.54*2.80*2.02*0.1990.184-0.614-1.238注：*与*分别代表与对照进行一维方差分析在0.05与0.0l水平上的差异显著性Note:*and*presentthesignificantdifferenceat5%and1%levels,respectively,comparedwithcontrol图1.一枝黄

26、花浸提液对蚕豆根尖有丝分裂的影响Fig1.TheeffectofSoIidagodecurrensL.onmitoticindexofViciafabaroottipcells从表1、图1可知，一枝黄花水浸提液对蚕豆根尖细胞有丝分裂指数有明显的抑制作用，浸提液对有丝分裂的抑制效应与处理时间和浸提液浓度呈正相关，即随着浓度的升高和作用时间延长，抑制效应增强。与对照组比较，各处理组蚕豆根尖的有丝分裂指数差异达到极其显著水平（P0.01）；在处理后期（72h）后，0.025g/mL与0.050g/mL处理，有丝分裂指数略高于对照组，可能是由于有一定化感物质的存在，浸提液的渗透势较小，在一定程度上减缓

27、了水胁迫，但随着化感物质浓度的增加，这种缓解效应失。一枝黄花水浸提液对有丝分裂指数的RI值，也反映了一枝黄花水浸提液对蚕豆根尖细胞有丝分裂指数有明显的抑制作用。3.2一枝黄花浸提液对蚕豆根尖细胞微核率的影响表2.一枝黄花浸提液对蚕豆根尖微核率的影响Table2.TheeffectofaqueousextractsofSoIidagodecurrensthemicronucleusratioofviciafabaroottipcells水浸提液浓度（g/mL）concentrationofaqueousextracts24h48h72h微核率ThefrequencyofmicronucleusR

28、I微核率ThefrequencyofmicronucleusRI微核率ThefrequencyofmicronucleusRI0.0000.0250.0500.0750.1001.03.6*4.6*4.8*5.6*0.7220.7830.7920.8212.64.8*6.2*10.0*10.4*0.4580.5810.7400.7505.26.8*9.4*10.6*10.8*0.2350.4470.5090.519注：*与*分别代表与对照进行一维方差分析在0.05与0.0l水平上的差异显著性Note:*and*presentthesignificantdifferenceat5%and1%le

29、vels,respectively,comparedwithcontrol图2一枝黄花浸提液对蚕豆根尖微核率的影响Fig2.ThemicronucleusofViciafabaroottipcellsinducedbyaqueousextractfromSoIidagodecurrens一枝黄花水浸提液诱发了较高频率的微核（表2、图2），同样具有处理时间和浸提液浓度的双重依赖。即随着处理时间的延长和浓度的升高，各浓度处理的微核千分率明显升高趋势。与对照组比较，各处理组蚕豆根尖的微核千分率差异达到极其显著水平（P0.01）。3.3一枝黄花浸提液对蚕豆根尖细胞染色体畸变的影响在一枝黄花水浸提液处理

30、下蚕豆根尖染色体出现了很多异常现象：微核、类微核、染色体桥、染色体断片、染色体粘连、染色体滞后等多种畸变类型。在细胞分裂的各个时期还有有微核和类微核的出现(图3)，数目不等。单微核（间期微核）双微核前期类微核中期类微核后期类微核后期染色体单桥末期染色体双桥末期染色体断片后期染色体粘连末期染色体滞留及断片末期类微核后期滞留染色体图3.一枝黄花水浸提液诱导的蚕豆根尖染色体畸变Fig3.ChromosomalaberrationsofroottipcellsofviciafababyaqueousextractsofSoIidagodecurrens4、讨论分析有丝分裂指数代表根尖分裂细胞数占分生区

31、细胞总数的比例，其值越高，表明根尖细胞分裂越旺盛，生长良好。化感物质可以抑制有丝分裂过程中纺锤丝的形成，破坏了纺锤丝的的正常结构和功能，从而抑制细胞分裂19。本研究结果表明，在一枝黄花水浸提液作用下蚕豆根尖细胞有丝分裂指数下降，可能是一枝黄花在入侵过程中，营养器官分泌化感物质到土壤中，抑制了周围其他植物根部生长，从而导致其他植物生长发育不良，甚至死亡。本实验结果显示一枝黄花水浸提液能诱发较高频率的微核，水浸提液处理组的微核千分率明显高于对照组，这种效应具有时间效应和浓度效应。同时，在一枝黄花水浸提液的作用下，蚕豆根尖细胞出现了多种染色体畸变现象，表明一枝黄花水溶性化感物质破坏了蚕豆根尖细胞纺锤

32、丝的正常结构与功能，由于染色体断裂再融合形成双着丝粒和无着丝粒的染色体片断而形成了桥，所有桥的形成伴随着染色体断片的出现20；由于个别染色体受损或活动异常，从而导致染色体滞留现象20。此外，一枝黄花水溶性化感物质可能干扰了DNA损伤的正常修复，导致形成的染色体断片和滞后染色体无法向极运动，便在子核重建时，形成了游离于主核的微核。由此可见，一枝黄花水溶性化感物质具有一定的遗传损伤效应。由此推测一枝黄花的化感作用可能是其成功入侵和快速扩散的机制之一。5、结语一枝黄花的水溶性化感物质降低了作物的有丝分裂指数，使作物的微核率升高，并诱导各种染色体畸变，具有一定的遗传毒性，推测一枝黄花的化感作用可能是其成功入侵和快速扩散的机制之一。由此可证明蚕豆根尖细胞微核试验在检测入侵植物的化感作用方面具有较大的应用价值。参考文献：1李晓岚,裘名宜,刘素鹏.一枝黄花的化学成分、药理活性及临床应用J.时珍国医国药.2008,19(1):93-94.2王玉兰.中药一枝黄花的药理作用分析J.中国民族民间医药,2010,03:313邹志明,周清平,应惠芳,等.一枝黄花的红外光谱法分析J.时珍国药国医.2007，18(2):312-313.4刘素鹏,李晓岚,裘名宜,等.一枝黄花总黄酮总皂苷对动物肠平滑肌运动的作用J.陕西中医,2009,30(7):926-92.5HierroJ.