非小细胞肺癌中PTB对肿瘤抑制基因ceacam1选择性拼接的调控研究

1、非小细胞肺癌中PTB对肿瘤抑制基因ceacam1选择性拼接的调控研究摘要目的：研究在非小细胞肺癌及癌旁组织中eaa1通过选择性拼接而产生的两种转录产物的调控机制。方法:将用PR方法获得eaa1基因中从内含子5至外显子8长1606bpDNA片段插入到真核表达载体pV中，构建成eaa1迷你基因模型并与ptb基因共转染，用PR法鉴定转染后的产物变化；根据外显子7序列设计的探针GAE16nt及AE8nt进展凝胶阻滞分析实验。别离与探针结合的蛋白并进展质谱分析。结果:ptb3种DNA与eaa1迷你基因共转染后，EAAlL表达程度下降，其中ptb4对迷你基因的表达产物影响最大。仅转染迷你基因的细胞中eaa

2、1L在两条带中所占比例为76.7%，而与ptb3种重组质粒共转染后，比例分别下降至58.3%、64.8%和54.0%。凝胶阻滞实验说明，探针GAE能与核蛋白结合，而AE根本不能与核蛋白结合，与GAE结合的蛋白经质谱分析为PTB。结论：PTB过表达与eaa1低表达有明显的相关性，拼接因子PTB参与eaa1的选择性拼接。关键词迷你基因；选择性拼接；癌胚抗原相关的细胞粘附分子1；拼接因子PTB；凝胶阻滞分析；非小细胞肺癌癌胚抗原相关的细胞粘附分子1(EAA1或A1)，在多种上皮细胞起源的肿瘤中起肿瘤抑制基因作用，属于免疫超家族基因1。该基因长约1.48kb，共有9个外显子组成，其中第七外显子长53b

3、p，位于EAA1的胞内端，可通过选择性拼接去除，从而产生EAA1L和EAA1S两种转录产物。EAA1L含外显子7，因此胞内端较长，而在EAA1S的形成中，由于外显子7被剪切，其胞内端少了73个氨基酸2。有研究说明，EAA1在多种肿瘤如肠癌、肝癌、乳腺癌和前列腺癌中的表达程度普遍下降34。当鼠的EAA1L被转入鼠的肠癌或乳腺等细胞时，细胞的生长速度明显减慢，恶性程度降低57。Estrera等8研究认为，仅表达EAA1L的胞内局部即能产生抑制肿瘤生长的作用，因此EAA1L的胞内端对抑制肿瘤的生长是必需的。在肺癌中，RNA原位杂交和Nrthernblt分析结果说明，EAA1L在75%的肺癌旁组织高表

4、达，而EAA1S在84%的肺癌组织中高表达9。根据此现象，我们推测EAA1第7外显子的选择性拼接与某种拼接因子有关，EAA1两种拼接产物的表达谱受到该因子的调控。为了验证此假设，我们采用了迷你基因模型及凝胶迁移等实验说明了eaa1的第7外显子序列能与拼接因子PTB(plypyriidinetratbindingprtEin，hnRNP)特异结合，EAA1L和EAA1S的表达比例与拼接因子PTB的表达程度相关。1材料和方法1.1菌株、质粒及试剂大肠杆菌DH5由作者所在实验室保存。限制性内切酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司，pleteTprteaseinhibitrktail购自Rhe公司

5、，BA蛋白定量试剂盒购自Piere公司，LipfetAINET和RNAzl试剂购自Invitrgen公司,NnidetP40(NP40)购自Siga公司。12方法1.2.1细胞培养人非小细胞肺癌H157、H1944细胞株由美国.D.安得森癌症中心毛力先生惠赠。细胞在37、5%2、DE/F12培养基含5%的小牛血清、100Ul-1青霉素和100gl-1链霉素中生长。1.2.2eaa1迷你基因及ptbpDNA重组质粒的构建从H157细胞株提取RNA，以随机引物为模板逆转录成DNA，用RTPR方法获得eaa1基因中从内含子5至外显子8长1606bpDNA片段，经酶切后插入到真核表达载体pV中，重组质

6、粒经测序鉴定。引物序列为：5GGGGTAATGAAAATAATGTTA3和5AAAAGTTGTTAGGTGGGTATTGG3。为了防止内含子5和外显子6的连接处拼接位点对拼接可能的影响，我们将内含子5拼接位点内的“ag突变为“aa。PTB1、PTB2和PTB43种pDNAPTB表达载体由冷泉港实验室DavidHelfan惠赠。1.2.3eaa1迷你基因与ptbpDNA共转染选用H1944细胞株作为eaa1迷你基因及ptbpDNA共转染的宿主细胞，实验按LipfetAINET转染试剂盒操作说明书进展。细胞在100培养皿中长至约80%，参加DNA/lipfetAINET混合物10g40l-1，室温

7、放置40in和4l无血清、无抗生素的培养基混合物，37培养6h后，更换为含有血清和抗生素的培养基。转染72h后搜集细胞，用RNAzl提取总RNA，每种载体重复转染3次。用PR法检测转染后细胞内的eaa1的表达产物。上游引物是位于外显子6中的序列S1：5GGTTGTTGATAGAGTAG3；下游引物为载体上的T7序列S2：5TAATAGATATATAGGGAG3。PR反响条件如下：94变性1in，55退火1in，72延伸2in，25个循环。PR产物经测序鉴定。1.2.4核蛋白抽提物制备10细胞培养至80%90%密度，去除培养液，用预冷的PBS洗两次后搜集细胞，重悬于500l缓冲液A中(含10lL

8、-1Kl、1.5lL-1gl2、10lL-1DTT,0.1%NP40、10lL-1Hepes、1lL-1PSF及1pleteTprteaseinhibitrktail，pH7.9，4)，冰上保温30in后离心10in搜集沉淀。重复上述步骤2次，沉淀重悬于100l缓冲液B(0.42lL-1Nal,0.2lL-1EDTA，25%glyerl，20lL-1Hepes，5lL-1DTT及10lL-1PSF，pH7.9，4)，离心搜集上清，对0.1PBS含1lL-1DTT和1lL-1PSF透析。蛋白浓度用BA蛋白试剂盒测定。1.2.5PTB的表达与eaa1两种表达产物的相关性分析抗PTB的单克隆抗体由冷

9、泉港实验室DavidHelfan惠赠，按150稀释，免疫组化实验步骤按文献11进展。非小细胞肺癌的肿瘤组织及癌旁组织由.D.Andersn癌症中心病理学系提供。按文献12提取临床标本的核蛋白，1上样缓冲液SDSladingbuffer溶解，煮沸5in处理后行SDSPAGE。100V、1.5h将蛋白转至PVDF膜上，在含有20%Teen100的TBSTBST溶解的脱脂奶粉中封闭1h，抗PTB的单克隆抗体为一抗1200室温孵育1h，TBST清洗8次，每次5l，带有HRP标记的羊抗兔的二抗室温孵育1h，TBST清洗8次，每次5l，参加发光底物，X线片感光显色观察。1.2.6凝胶迁移阻滞实验根据eaa

10、1外显子7的核酸序列设计两个探针：AE，5AAAA3；GAE，5AAGAAAAA3。用1.5i32PATP标记探针，用G25柱去除没有标记的32PATP。32P标记的探针约3ng与透析的H157细胞核抽提物(5g)在20lRNA结合缓冲液中含20%glyerl、5lL-1gl2、2.5lL-1EDTA、2.5lL-1DTT、250lL-1Nal及50lL-1TrisHl,pH7.5,冰上孵育30in，孵育物行7%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，压X线片，用标记的GAE互补链与细胞核抽提物的孵育物作阴性对照。2结果2.1重组载体的构建PR得到约为1.6kb的eaa1基因片段，经酶切连入真核表达载体pV

11、，构建的重组载体经测序鉴定，与GenBank中的基因序列一致，阅读框不变数据未显示。2.2eaa1迷你基因与PTB共转染eaa1迷你基因与ptbpV共转染的PR检测结果见图1。PTB1、PTB2及PTB4都影响eaa1的两种表达产物的比例，使eaa1L表达下降，其中PTB4的影响最大。仅转染eaa1迷你基因的细胞中，eaa1L占两条带的比例为76.7%，而与3种ptbpV共转染后，所占比例分别下降至58.3%、64.8%和54.0%。2.3PTB的表达与eaa1两种表达产物的相关性分析用PR法检测这些组织中eaa1两种产物的表达程度，实验结果见图2；用esternblt法检测5对非小细胞肺癌肿

12、瘤组织及癌旁组织中PTB的表达程度结果见图3。从图2、3可看出，在肿瘤组织中，eaa1S的表达程度明显高于癌旁组织，而在这些肿瘤组织中PTB的表达程度也较高，两者有明显的相关性。2.4凝胶迁移阻滞实验在人、鼠的eaa1外显子7中有23nt序列较保守，我们进一步发现，在富含A/的拼接增强子中常出现的3个AA元件,同样出如今eaa1的外显子7中，两个AAeleents存在于该保守的23nt序列中(图4)。根据上述保守序列设计了两个探针GAE和AE，在H157细胞株中检测了核抽提物和探针的结合才能。结果说明，含有2个AA的16nt探针GAE的结合才能明显强于含1个AA8nt的AE探针(图5)，结合产

13、物经质谱分析即为PTB蛋白。1.GAE与细胞核抽提物的孵育物；2探针；3标3讨论真核生物基来由外显子与内含子组成，通过转录形成的RNA前体必须去除内含子，将外显子拼接起来，才能形成成熟的RNA，作为翻译的模板。拼接有组成型拼接与选择型拼接两种，是基因表达的必经阶段，也是转录后遗传信息扩展的重要机制。有研究说明，人类因基因突变所致的疾病中，有15%是由拼接异常引起的。尽管拼接的缺失与肿瘤的因果关系还不非常清楚，但很多实验结果说明，人肿瘤中有很多基因拼接产物的比例发生了变化。PTB是hnRNP家族的一员，识别富含嘧啶的的核苷酸序列，能与U2AF竞争结合位点，在一些外显子选择剪切过程中起负调控作用。

14、文献报道受PTB调控的基因有fgfr1、GABAAreeptr2、sr、fibrnetin和或trpysin1315。免疫组化结果说明，在小细胞肺癌组织中PTB过表达与eaa1L低表达呈明显相关性。有研究说明，在人gliblasta细胞株中成纤维细胞生长因子受体1的62bp的内含子序列对于其外显子的去除是必需的16。我们推测在内含子6中应存在类似序列，因此构建了内含子6的一系列截短重组载体，并没有发现有类似功能的序列。比拟人、鼠EAA1外显子7的序列时发现，外显子7中的23nt序列较保守，我们进一步发如今富含A/的拼接增强子中常出现的3个AA元件,同样出如今EAA1的外显子7中，其中2个AAe

15、leents存在于该保守的23nt序列中(图4)。根据这些发现，我们设计了GAE和AE两个探针，在H157细胞株中检测了核抽提物和探针的结合才能。实验结果说明，含有两个AA的16nt探针的结合才能明显强于含1个AA的8ntAE，结合蛋白经质谱分析，即为PTB蛋白。至此我们首次证明了PTB在eaa1外显子7的选择性拼接中起拼接因子的作用，并发现了eaa1中能与PTB特异结合的序列，为进一步研究PTB对eaa1外显子7选择性拼接的调控机制及其在肿瘤发生过程的作用奠定了基矗参考文献1LAURIENA,EGYS,ARREiRP,etal.arinebryniantigenrelatedelladhes

16、inleule1a4LsuppressinfrathepatellulararinasJ.anerRes,2022,65(23):1101011017.2BEAUHEINN,DRABERP,DVEKSLERG,etal.RedefinednenlaturefrebersfthearinebryniantigenfailyJ.ExpellRes,1999,252：243249.3BABERGERA,RIETHDRFL,NLLAUP,etal.DysregulatedexpressinfD66a(BGP,A),anadhesinleuleftheEAfailyinendetrialanerJ.AJ

17、Pathl,1998,152：14011406.4KEGAAT，PNGR,LIY,etal.TherlefelladhesinleuleinanerprgressinanditsappliatininanertherapyJ.AtaBihiPl,2022,51(2):445457.5KLEINERANDI,DINNEYPN,ZHANG,etal.SuppressinfhuanbladderanergrthbyinreasedexpressinfA1geneinanrthtpidelJ.anerRes,1996,56:34313435.6LU,DG,EARLEYK,etal.Suppressin

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19、ssaryandsuffiienttsuppresstheturigeniityfprstateanerellsJ.BiheBiphysResun,1999,263：797803.9ANGL,LINSH,UG,etal.A1,aandidatetursuppressrgene,isabnrallyexpressedinpriarylunganersJ.linialanerRes,2000,6:29882993.10DIGNAJD.PreparatinfextratsfrhighereukarytesJ.ethdsEnzyl,1990,182:194203.11SRIAJ,LEEHY,LEEJ,etal.LakfPTENexpressininnnsallelllunganeruldberelatedtprterethylatinJ.linanerRes,2002,8(5):1178