线粒体自噬在疾病中的作用-学术报告

1、线粒体自噬在疾病中的作用武汉大学珞珈讲堂 自噬基因（autophagy-related gene，ATG）的克隆始于酵母（yeast）。第一个酵母自噬基因（ATG）于1997年被日本科学家Yoshinori Ohsumi小组克隆，命名为Atg1，文章发表在Gene上 。第一个哺乳动物自噬基因于1998年被美国科学家Beth Levine小组克隆，命名为Beclin 1，发表在J Virol。 Beth Levine 博士，首先克隆了第一个哺乳动物自噬基因Beclin 1 ，美国德克萨斯大学西南医学中心自噬研究部门负责人、内科学及微生物学系教授，1999年，他发现了第一个与乳腺癌抑制因子相关的哺

2、乳动物自噬基因beclin1，这是科学家们首次发现与人类基因相关的自噬基因。自噬已成为研究热点自噬（Autophagy）自噬：是一种溶酶体依赖性降解途径，主要涉及细胞内长寿蛋白和受损伤细胞器的降解，其既是细胞保守的自我防御机制，又是一种程序性细胞死亡机制，与机体的多种疾病有着密切关系。 降解细胞中物质的途径 形成自噬体：大多数长寿命蛋白质和损坏的细胞器蛋白酶体消化：短寿命蛋白自噬与多种疾病有关细胞自噬的生物学意义 1. 应激功能 细胞自噬是细胞在饥饿条件下的一种存活机制。 当营养缺乏时，细胞自噬增强，使非关键成分降解， 释放出营养成分，以保证过程的继续。2. 防御功能 在细胞受到致病微生物感染

3、时，细胞自噬起一定的防御作用。 如：单纯疱疹病毒感染时，在自噬囊泡中发现有病颗粒。3. 维持细胞稳态 在骨骼机和心肌，细胞自噬有特殊的“看家”(house keeping)功能，帮助细胞浆成分，包括线粒体，进行更新。 4.延长寿命：细胞自噬可降解损伤的细胞器、细胞膜和变性蛋白等胞内成分。 如果细胞自噬受损衰竭，细胞损伤就会堆积、累加，产生老化。5. 控制细胞死亡及癌症 在PCD过程中表现出细胞自噬的特征。因而有人提出： 自噬性细胞死亡(autophagic cell death) 昆虫蜕变时细胞发生的PCD被认为是自噬性细胞死亡的最典型 例子。当前，决定细胞自噬导致细胞死亡，还是维持细胞存活的

4、因子尚不完全清楚。所以，细胞自噬与细胞死亡之间的因果关系还没有最后定论。自噬的分类：细胞自噬的分类 1、巨型细胞自噬 (macroautophagy),又称为大自噬， 是指细胞内新生的杯状脂质双层包裹胞浆蛋白和细胞 器，并运送到溶酶体降解的自噬行为。 2、微型细胞自噬 (microautophagy),又称为小自噬， 是指通过溶酶体膜的内陷、突起和/或分隔，直接吞 入细胞浆的自噬行为。 3、分子伴侣介导的细胞自噬(chaperone mediated autophagy,CMA),是指由分子伴侣将靶蛋白转送至溶酶体内的自噬行为。这只见于哺乳类动物细胞。自噬的信号通路一.自噬的发生过程诱导自噬发

5、生富营养条件抑制自噬的发生饥饿诱导自噬的发生 3-磷酸磷脂肌醇激酶（PI3K）/Tor参与调控自噬的发生Science, 2000, 290(5497):1717-21.自噬的诱导发生 (杨四军等 JBC oct 2013 )FIGURE 1. 0.5 mM PA stimulated proper autophagy activation in INS-1(823/13) cells. A, PA stimulated expression of autophagy activation-associatedproteins LC3II/LC3I, p62, lysosome-associa

6、ted membrane protein (Lamp2), and CTSB. INS-1(823/13) cells treated with 0, 0.25, 0.5, and 1mM PA were analyzed by immunoblotting. -Actin was used as a control. B, ratio of LC3II/actin was analyzed in INS-1(823/13) cells treated with 0, 0.25, 0.5, and 1 mM PA for 12 h (*, p 0.01). C and D, cells sta

7、ined with LC3 antibody followed by secondary antibody (green) were visualized by confocal microscopy. INS-1(823/13) cells treated with 0.5mM PA (D) were compared with control (0mM PA) (C). E, the number of cytoplasmic puncta/cell is shown. Data are expressed as meanS.D. (error bars) from three indep

8、endent experiments (analyzed by t test; *, p 0.01 compared with control group).二. 形成自噬体自噬被诱导后，两层膜的自噬体就在胞浆中形成，将要被降解的胞浆成分隔离开来，形成双层膜自噬体。三.与溶酶体融合哺乳动物细胞中，自噬体在溶酶体上定植，以及与溶酶体融合。四.自噬体的崩解自噬体到达溶酶体后，两层膜与溶酶体膜很快融合。Science, 2000, 290(5497):1717-21.自噬的步骤步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，

9、就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，为“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合。步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆

10、中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。自噬的作用“双刃剑”一方面，自噬参与降解异常蛋白质，有助于防止细胞内异常蛋白质的蓄积，对生物体正常发育、面对环境胁迫的响应极为重要，对防止某些疾病，如心肌病，肿瘤、神经退行性疾病病变、病原微生物侵染以及对防止老化、延长寿命有积极作用；另一方面，自噬过度活跃又会损伤细胞器，如造成线粒体功能障碍，从而对细胞有害。过度激活的自噬体行为可能参与神经退行性疾病的致病过程。自噬的特性：自噬是细胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门

11、。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别。“捕获”胞浆成分的非特异性：由于自噬的速度

12、要快、量要大，因此特异性不是首先考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来。线粒体线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。功能：参与细胞呼吸释放能量，氧化磷酸化合成ATP等Cells keep their energy balance and avoid oxidative stress by regulating mitochondrial movement（移动）,distribution（分布）, and cle

13、arance（清除）.线粒体动力学MTKHCmiltonmiro+movinghealthy+unhealthyMTmiltonKHCUbParkinPINK1Pmirostop线粒体受到损伤时，miro/milton/ KHC复合体中，miro被磷酸化，激活蛋白酶体降解通路，当miro被降解，milton、KHC脱离了线粒体表面，线粒体运动停止，损伤的线粒体通过自噬被清除，是细胞维持自身稳态的一种重要调节机制正常情况下，线粒体通过miro/ milton/ KHC复合体建立与微管的联系，通过KHC沿着微管在细胞内运动，维持细胞内正常能量供应，保证各项生理活动正常进行。Miro/milton/

14、KHC三者通过miro与线粒体表面相连，milton连接KHC，KHC连接微管。Parkin依赖的线粒体自噬线粒体自噬，利用吞噬泡和溶酶体降解受损的线粒体，维持细胞内的平衡。Pink1/Parkin是一种重要的自噬调控途径。Pink1是一个丝氨酸/苏氨酸激酶, Pink1能磷酸化Parkin, 促进Parkin由胞浆到线粒体的转位。Parkin是一个E3泛素连接酶当线粒体损伤后, 线粒体膜电位下降, 引起Pink1蛋白在损伤线粒体上的积累, 能够吸引Parkin到损伤的线粒体上。Parkin使得线粒体外膜上的很多蛋白发生泛素化, 介导线粒体被吞噬泡吞噬，后与溶酶体结合，被水解酶消化。线粒体自噬

15、与线粒体功能障碍线粒体“动力工厂”，在氧化磷酸化过程中产生的超氧化物等活性氧（ROS）可引起氧化应激反应，导致线粒体功能衰退。糖尿病患者体内，抗氧化能力失调，导致由氧化应激介导的细胞损伤加重，线粒体功能失调。ROS水平增高，激活自噬后通过清除损伤的细胞器或蛋白质，降低ROS对细胞的毒害作用；相反，这些降解和清除行为会使ROS进一步聚集，促使胰岛素抵抗的法伤，导致心血管疾病、肾病和神经系统的损伤。能量线粒体ROS氧化应激反应线粒体功能衰退 1. 观察自噬体的形成：由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层

16、膜，有包绕 胞浆成分的趋势。自噬体的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层 膜，胞浆成分已降解。自噬的检测：线粒体自噬(杨四军等, sep 2017 oncotarget)自噬的检测： 2. 在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成：由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自

17、噬体，可以 通过计数来评价自噬活性的高低。CmitoRFP GFP DAPI MergeFlox-HFDIKO-HFD自噬的检测：3. 利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成：自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。（Note：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）自噬的诱导发生 (杨四军等 JBC oct 2013 )FIGURE 1. 0.5 mM PA stimulated

18、proper autophagy activation in INS-1(823/13) cells. A, PA stimulated expression of autophagy activation-associatedproteins LC3II/LC3I, p62, lysosome-associated membrane protein (Lamp2), and CTSB. INS-1(823/13) cells treated with 0, 0.25, 0.5, and 1mM PA were analyzed by immunoblotting. -Actin was us

19、ed as a control. B, ratio of LC3II/actin was analyzed in INS-1(823/13) cells treated with 0, 0.25, 0.5, and 1 mM PA for 12 h (*, p 0.01). C and D, cells stained with LC3 antibody followed by secondary antibody (green) were visualized by confocal microscopy. INS-1(823/13) cells treated with 0.5mM PA

20、(D) were compared with control (0mM PA) (C). E, the number of cytoplasmic puncta/cell is shown. Data are expressed as meanS.D. (error bars) from three independent experiments (analyzed by t test; *, p 0.01 compared with control group).自噬的检测 4. 检测长寿蛋白的批量降解：非特异5. MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：包括自

21、噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。自噬的检测：6. MitoTrackerTM Green染色：在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。H

22、sp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔线粒体自噬(杨四军等, sep 2017 oncotarget)自噬与神经退行性疾病细胞自噬与神经元退行性变疾病 细胞自噬的减弱，可能与神经元退行性变疾病的发生有密切 关系。 正常情况下：UPS泛素蛋白酶体系统-和CMA-分子侣伴介导的自噬，负责降解细胞内的可溶性蛋白成分； 疾病代偿期：UPS和CMA,异常蛋白形成复合体堆集； Macrophagy,清除堆集的变性蛋白复合体； 疾病失代偿期： UPS和CMA 异常蛋白堆集 自噬小泡累积，Macrophagy有研究显示，使用促进细胞自噬的药物，如Rapamycin(雷帕霉素)可改善帕金森病(Parkinsons disease, PD)、阿尔茨 海默病(Alzheimers disease, AD)等疾病的病情。自噬在神经退行性疾病中的作用：细胞自噬与感染性疾病： 研究表明，细胞自噬是机体重要的抵抗病原微生物的通路。 细胞自噬对免疫和感染具有多种作用，包括： 1、激活先天性免疫和获得性免疫； 2、维持免疫细胞的稳态； 3、降解病原微生物等。 但是，大量的免疫信号也可以调节细胞