艾滋病与人类免疫缺损病毒的分子生物学

1、艾滋病与人类免疫缺损病毒的分子生物学Molecular biology of acquired immunodeficiency syndrome and human immunodeficiency virus 第十四章内容8.1 概述8.2 HIV病毒的形态结构与传染8.3 HIV基因结构及编码的蛋白8.4 HIV的感染与复制8.5 HIV基因的表达调控 8.6 病毒的致病机制8.7 病毒感染与机体免疫8.8 病毒感染的诊断8.9 艾滋病的治疗和预防.概述 HIV在病毒分类学上属逆转录病毒科（Retroviridae），慢病毒属中的灵长类免疫缺损病毒亚属，包括两种，即HIV-I和HIV-I

2、I。该病毒科中共有7属。 反转录病毒科的主要成员如下表1。 表1.HIV病毒的形态结构与传染一、形态结构 1、HIV结构(平面)图.12. HIV结构(立体)图.2 传播途径： 血液、血液制品以及人体分泌液，如奶液和精液等。 传播对象： T淋巴细胞，也可以感染其他类型如B淋巴细胞和单形核细胞等。 危害：HIV能够攻击人体的免疫系统，特别是能够侵入T细胞，使T细胞大量死亡，导致患者丧失一切免疫功能。二、病毒的传染.HIV基因结构及编码的蛋白一、基因结构 HIV基因组由两条单链正链RNA组成，每个RNLA基因组约为9.7 kb。在RNA 5端有一帽子结构(m7G5GmpNp)，3端有P0ly(A)

3、尾巴。由结构上包括LTR，结构蛋白编码区（gag），蛋白酶编码区（pro），多种酶活性的蛋白编码区（pol），外膜蛋白（env）编码区以及6个调节基因。见(图3)、（图4）。 图.3图.4 HIV基因结构及编码的蛋白 二、编码蛋白的功能 1. gag基因: gag基因编码病毒的核心蛋白，翻译时先形成一个分子量大约是55kD的前体蛋日（p55），然后在HIV蛋白酶的作用下裂解成p17、p24、p15三个蛋白质。p24和p17分别参与构成HIV颗粒的内壳和内膜，p15进一步裂解成与病毒RNA结合的核壳蛋白p9和p7。2. pol基因: pol基因编码病毒复制所需的酶类，其中p66蛋白为逆转录酶，p

4、32蛋白则为整合酶（integrase，INT）。3. pro基因 : 从pol和gag基因重叠区内起始的一段序列为pro基因，它编码蛋白酶p22，p22在裂解上述HIV蛋白前体形成终末成熟蛋白的过程中起着主要作用。4. env基因: env基因先编码出一个 88 kD的蛋白质，经糖基化后分子量增至 160kD，这就是HIV包膜糖蛋白前体gP160。该前体蛋白在蛋白酶作用下被切割成gp120和gp41，gp120暴露于病毒包膜之外称外膜蛋白。 . HIV的感染与复制 图.5 HIV的感染过程 HIV的感染 HIV感染细胞时可与细胞的CD4受体蛋白相结合；gp41称跨膜蛋白，是嵌入病毒包膜脂质中

5、的部分。当gp120与CD4受体结合后，其构象改变导致与gP41分离，暴露出的gp41可插入细胞膜，造成膜融合，致使病毒核心被导入细胞。HIV与受体结合后，病毒核心进入细胞并在酶作用下脱去蛋白壳。RT以病毒RNA为模板合成单链DNA，随之经细胞的DNA聚合酶合成双链cDNA。cDNA经环化后整合到细胞染色体上，病毒核酸随细胞的分裂而传至子代细胞，十分稳定，可长期潜伏。 原病毒整合到宿主染色体上,无症状; 原病毒利用宿主细胞的转录和合成系统产生病毒mRNA,其中一部分编码病毒蛋白,与基因组RNA组装成新的病毒颗粒,从宿主细胞中释放出来侵染其他健康细胞; 宿主细胞死亡.主要过程总结如下:.HIV基

6、因的表达调控 LTR序列 (1)核心调控元件 (2)核心转录单位 (3)反式作用因子应答元件 参与复制的调控蛋白 (1)Tat蛋白 (2)Rev蛋白 (3)Nef蛋白 (4)Vpr蛋白 (5)Vpu蛋白 (6)Vif蛋白 一、LTR序列 1. 核心调控元件 2. 核心转录单位 3. 反式作用因子应答元件（见图6）调节单位 核心单位TRA 图.61.调节单位Coup-TFAP-1NF-ATUSFTCF-1NF-453-78图.7Coup-TF-371-334 鸡卵蛋白转录因子 是coup-F家族中相对低分子量蛋白 含有锌指环结构，起负调节作用AP-1 激活蛋白1 由含亮氨酸拉链结构的c-jun和

7、c-Fos家族成员组成的二 聚体，属于正调节因子-347-329NF-AT 激活T细胞核因子（有两个结合位点）。-292 -235 -216 -203USF 上游激活因子 含有螺旋-环-螺旋结构 具有负调节作用-160-173TCF-1 T细胞因子1a 含有高速泳动簇基序 ，起正调节作用 -139 -124NF- 核因子 含有锌指环结构及锚定蛋白重复序列，是增强子区。由3-4bp间隔的两个10bp（GGGACTTCCC）序列构成，负责调控HIV基因在多种细胞（尤其是T细胞）中高速表达。-104-782. 核心单位-780 SP1 TATA图.8 SP1 Sp1含有与DNA结合的结构和两个富含谷

8、氨酰 胺的结构域。可形成二聚体或三聚体。当三个sp1分子与DNA结合后，改变了DNA的空间构型，激活HIV基因的转录。-78 富含GC -46TATA TATA元件两端有反向重复序列，可能是转录因子螺旋-环-螺旋DNA结合蛋白的识别位点。 TATA元件上结合的是一组蛋白质，这些蛋白称为转录因子D（TF D ），也包括一些辅助激活蛋白（TBP）的细胞因子，这种作用是与RNA聚合酶相关，由此启动转录。-24 -283. TRA图.9 TRA (反式激活因子应答元件)似发夹结构，含有4个茎区和一个环区的稳定结构， 此结构与tat蛋白结合有关。 只有与tat蛋白共结合，才能转录出长mRNA， 否则只能

9、转录出小段的mRNA。二、参与HIV复制的调控蛋白 1. Tat蛋白 2. Rev蛋白 3. Nef蛋白 4. Vpr蛋白 5. Vpu蛋白 6. Vif蛋白（1）Tat蛋白的结构 由tat基因编码， tat有两个外显子，前外显子编码67aa,后外显子编码34aa，共101aa。 两个外显子所形成的肽共有6个结构区。前外显子有5个区，后外显子为一个区。见（图.10）1.Tat蛋白 Tat蛋白有6个结构区，见下图，其中第一、第二和第四个三个结构区与反式激活功能有关。图.10 Tat蛋白的结构示意图 第1区为N区，也是酸性氨基酸区，因含有Gln和Asp对激活HIV-1基因的表达有增强作用。 第2区

10、为富含Cys区，在其16个aa中含有7个Cys,可以与二价金属离子形成tat二聚体，在7个Cys中有6个是维持tat活性所必需的。 第4区为碱性区，有两个功能： 4852为GRKKR（甘-精-赖-赖-精）序列，是核仁定位信号，可介导自身或异种蛋白进入细胞核。 该肽段可与TAR的RNA的凸起部分特异结合。（2）调控原理 Tat与TAR是一个协同调解过程。 TAR序列及完整的高级结构对调控的影响。若TAR序列发生突变，虽tat蛋白也能结合，但不能激活HIV表达。 寄主因子协同作用的影响 在不同的细胞中，tat的活性可有上千倍的差别，在人鼠杂交细胞中，只有在保持人第12号染色体的杂交瘤细胞中，tat

11、才能有效地激活HIV-1的转录。说明其调控还需寄主细胞编码蛋白的协助作用。 上游启动子和增强子对调控的影响 当TAR远离启动子时，它的活性迅速下降。而且这种依赖作用对非激活和激活细胞并不一样，对激活细胞作用非常大，而NF- 的作用恰与上述依赖作用相反。 Rev蛋白由两个外显子组成，分别编码一个25个氨基酸和91个氨基酸的肽段，这两个肽段最终组成一个 116个氨基酸、其主要功能是促进HIV基因表达由早期（转录调节蛋白mRNA）向晚期（转录HIV结构蛋白mRNA）的转化，并促进晚期转录的进行。2. Rev蛋白 Nef蛋白由Nef基因编码的，分子量为27kD，属于负调控蛋白和磷酸化蛋白，与细胞的膜结

12、构相结合。Nef蛋白非HIV复制所必需，但可抑制 HIV LTR特异性转录的HIV1原病毒基因的表达。3. Nef蛋白 Vpr蛋白由96个氨基酸构成，亦非HIV复制所必须，但存在于病毒颗粒中。含有vpr基因的HIV毒株与无vpr基因的HIV毒株比较，前者在细胞中生长较快，致细胞病变也较强于无vpr基因的天然株。4. Vpr蛋白 Vpu蛋白是含81个氨基酸的磷酸化蛋白，为HIV1特有，其功能可能是促进HIV1颗粒的装配和从细胞膜释放，或抑制HIV1颗粒从细胞内膜系统中芽生。5. Vpu蛋白 Vif蛋白是分子量为23kD的病毒颗粒感染性因子，缺失Vif基因的HIV1可在细胞内正常复制并产生病毒颗粒

13、，但其比无Vif基因缺失的HIV-1产生的病毒颗粒的感染性低1000倍。6. Vif蛋白HIV复制与细胞表达图解RNARTcDNA(单链)DNA聚合酶环化细胞染色体切割酶切口切口p32DNA(双链)LTRSp1 TATA TAR gag pol vpr vpu env nefLTRRevratvif指导调控基因表达(结构基因不表达)Tat蛋白tatRev蛋白nef蛋白Vpu蛋白Vpr蛋白Vif蛋白RevRev运入 细胞质结构基因表达结构蛋白RNA组装新的HIV 侵染 转录mRNAmRNA迅速被切割运入细胞质转录不被切割.病毒的致病机制 一、临床症状 感染的急性期： HIV初次感染人体后，开始大

14、量复制和扩散的过程，这时感染者血清出现HIV抗原，从外周血细胞、脑脊液和骨髓细胞也能分离到HIV。 无症状潜伏期： 约70以上的原发感染者在感染后24周内出现急性感染症状，包括发热、咽炎、淋巴结肿大持续12周， 此期感染者无任何临床症状，形同健康人，外周血中HIV抗原含量很低或检测不到。 艾滋病相关综合症期： 随感染时间的延长，HIV重新开始大量复制并造成免疫系统的进行性损伤。在临床上，病人感染逐步发展到持续性全身性淋巴腺病、艾滋病相关综合症（AIDSrelated complex，ARC）。约有50的感染者在感染后78年发展到艾滋病。 产毒性HIV感染的最终结果是产生大量病毒颗粒，造成感染细

15、胞死亡，这是逆转录病毒科慢病毒亚科病毒的特征。 HIV除在细胞内大量繁殖造成细胞死亡外，还可经以下几种情况导致免疫功能下降： HIV颗粒表面的gp120蛋白脱落，与正常 TH细胞膜上 CD4受体结 合，该细胞被免疫系统误认为是病毒感染细胞而遭杀灭。 因TH细胞CD4受体被gpl20封闭，影响其免疫辅助切能。 HIV gp120蛋白可刺激机体产生抗其CD4结合部位的抗独特型抗体，此抗体是抗CD4受体的抗自身抗体，可阻断TH细胞的功能。 受染细胞表面带有病毒包膜蛋白gp120，可与其他CD4+细胞结合并形成巨细胞而失去功能，如此加速了HIV对免疫系统损害的范围和程度。二、病因：病毒的致病机制超抗原

16、（superantfeen）： 超抗原 可导致小鼠体内特定的T淋巴细胞亚群的消失和免疫缺损的发生。普通抗原需要经T淋巴细胞受体的和两条链的识别才能激活一细胞。体内有多种链和链，二者可任意配对，构成极为多样的受体组合和表面带该抗体的T淋巴细胞亚群，而超级抗原则与T淋巴细胞受体链结合，导致所有带有此链的T淋巴细胞亚群均被激活。而且与被普通抗原激活的结果不同，这些T淋巴细胞亚群不是产生了对抗原的免疫反应并分裂增生，而是丧失了对抗原的反应。并逐渐从免疫系统中消失。.病毒感染与机体免疫一、体液免疫 HIV自然感染过程中，机体可产生高滴度的抗HIV多种蛋白质的抗体，包括中和抗体。中和抗体尽管有组特异性的，

17、但主要是型特异性的。这些抗体有一定的保护作用，主要是在急性感染期降低血清中的病毒抗原量乃至清除病毒 。二、细胞免疫 HIV感染也刺激机体产生细胞免疫，包括依赖于抗体的细胞毒性（antibodydePendent cell mediated cytotoxicity，ADCC）、细胞毒性T淋巴细（cytotoxic T lymPhocyte，CTL）和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）等。特异性细胞免疫反应，特别是CTL对于杀伤HIV感染的细胞和阻止HIV经细胞接触而扩散发挥重要作用，CTL可以帮助清除急性感染期多部位HIV感染灶和HIV感染早期的少量有HIV复制的细胞

18、。.病毒感染的诊断 艾滋病诊断就是要找出HIV感染的证据，即HIV抗原或抗HIV抗体的存在。一、抗原检测 1、病毒分离 2、逆转录酶测定 3、核酸测定二、血清学诊断 HIV感染血清学诊断的方法有多种，与各种方法均是独立的确诊实验的抗原检测方法不同，每种血清学诊断方法各有所长及不足，常常按一定的组合配合应用，以互相补充，达到做出高效、正确诊断的目的。 .艾滋病的治疗和预防一、治疗 迄今为止，虽然对艾滋病的研究受到了高度重视，仍无任何药物可以完全抑制HIV在感染者体内的增殖并彻底治愈艾滋病。目前，已批准的抗HIV病毒药物主要有：核苷酸型反转录酶抑制剂（表2）、非核苷酸型反转录酶抑制剂（表3）和蛋白

19、酶抑制剂（表4）。 核苷酸型反转录酶抑制剂 Abacavir(ABC) Stavudine(d4T) Didanosine(ddl) Zalcitabine(ddc) Lamivudine(3Tc) Zidovudine(AZT)表.2非核苷酸型反转录酶抑制剂EfavirenzNevirapineDelavirdine 表.3蛋白酶抑制剂AmprenavirIndinavirLopinavirNelfinavirRitonavirSaquinavir 表.4二、预防 病毒疫苗 1. HIV疫苗应用与失败 在HIV疫苗应用的巨大市场两方面因素的驱动下，早期HIV疫苗的研究无不急功近利地采用了最简捷的方法，将重点放在合成肽和基于实验室传代毒株的亚单位疫苗 gp120、gp160方面。经过几年的努力完