PCR技术原理-资料

1、定量PCRi：技术原理陈云地8008100192407chenyd2004年1内容提要 基本概念 定量PCR的数学原理 定量PCR的化学原理 硬件性能 软件系统2定量的基本概念两种定量目标绝对定量相对定量“ 600个拷贝”“ 增加10倍”4标准曲线方法标 准 品未知样本5CT值对拷贝数的曲线1250 copies2500 copies5,000 copiesCT = 24.810,000 copies20,000 copies浓度= 4000 拷贝PCR的基本概念PCR原理链式反应的雪崩效应5355335forward primer5353555335535reve

2、rse primer535533553553533555355355353355533553553358PCR 理论方程N = N0 x (1+E)nN: 扩增子数量N 起始模板数量0:E： 扩增效率n: 循环数9PCR动力学曲线10PCR分期平台期Plateau线性增长期LinearLog DNAy = x(1+e)n指数增长期Geometric循环数11定量PCR的基本概念两种定量方法“产生了6000000000个拷贝”终点定量线性图谱半对数图谱起点定量 “加进去600个拷贝”13两种定量方法终点分析：没有严格规律对数期分析：平行性好14两种定量方法终点产物数量：误差太大同一个样品重复96

3、次PCR实验拐点产物数量：重现性好15对数期定量的优势z 起始DNA量，更具意义z 重现性好，误差小z 扩增效率恒定，标准曲线呈线性16实时荧光PCR的基本概念实时荧光定量PCR通过PCR来测定样品中的核酸数量通过荧光来检测PCR ，双倍放大模板可以是DNA或者RNA123456789101112log molecules18用荧光检测PCR 产物SYBR Green I 荧光标记扩增产物 动态监测荧光信号变化 荧光标记引物 特异性荧光标记探针TaqManTaqMan探针、分子信标、杂交双探针 荧光染料直接结合扩增产物SYBR Green I与DNA双链结合释放荧光信号19荧光信号的产生荧光基

4、团在激发光作用下，产生波长更长的发射光20“实时PCR” 指不开盖测定核酸闭管化学(污染的风险低)没有PCR后处理(无需走胶、拍照等)lens高度自动化定性：单数据点测定定量：多数据点测定能做基因分型及SNP鉴定21TaqMan的技术优势PipetSamplesReadResultsNo Gels!No Blots!22定量PCR的数学原理起点定量的关键：CT值CT值：荧光信号有统计学意义显著增长(穿过阈值线)时的循环次数线性图谱半对数图谱CT值CT值24为什么CT 起始DNA浓度?R = R + X (1+ E)n Rn B 0s总信号=本底信号+分子数量单位信号强度Rn 第n个循环时的总信

5、号RB 本底RS 单位信号强度X0 起始DNA数目E PCR效率25为什么CT 起始DNA浓度?R = R + X (1+ E)n RnB0s当循环次数n=CT值时：R = R + X (1+ E)CT RTB0slg (R - R ) = lg X + C lg (1+ E) + lg RTB0TsC lg (1+ E) = - lg X + lg (R - R ) lg RT0TBslog Xlog(R R ) log RCT = +OTBSlog(1 E )+log(1 E )XX即C = - k lg X + b （线性方程）T026C 值 - X 作图T0C = - k logX +

6、 bT0CTX0手工操作方法：阈值决定CT值阈 值CT阈值= 基线信号的标准偏差x 1028手工操作方法：基线决定阈值基线范围第3个循环-CT值前3个循环阈值高标准基线范围一般取3-15(进口试剂)或6-15(国产试剂)偏 度差- 3个循环根据实验结果调整29手工操作标准步骤1. 实验结束，软件根据默认值(3-15)自动分析数据给出初步C 值T2. 根据实验数据中 最小的C 值-3T得出基线终点3. 基线起点进口试剂取3，国产试剂取64. 设定新起止点，重新分析数据给出精确C 值T5. 正常情况下，两者相差不大。30自动操作方法软件自动计算全部参数：基线、阈值和CT值31定量PCR的化学原理两

7、种定量化学 染料染色 SYBR Green I 溴乙锭(Ethidium Bromide) 探针标记 TaqManTM TaqMan MGB Dual-oligo FRET pairs 分子信标(Molecular beacons) ScorpionsTM/AmplifluorTM33TaqMan探针RQ 一条探针，两条引物3535535引物位于探针的两边 一条探针，两个基团前边是报告基团，后边是淬灭基团 5 3Hybridises with the target ampliconIs 3 terminally blocked (cannot be extended by the polyme

8、rase)Has two fluorescent dyes attached: 1. Reporter (R) 2. Quencher (Q)34荧光共振能量转移(FRET)当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽。Frster resonance energy transfer through space(Frster Ann. Phys. 1948)35TaqMan探针的FRETFluorescent

9、Resonant Energy TransferTaqMan探针的FRETexternallightenergyenergytransferR = reporter Q = quencher37反应过程：探针杂交Reporter dyeQuencher dye反应过程：Taq酶的53外切活性5 Nuclease Assay：39荧光5 nuclease assay(TaqManchemistry)RQforward primerprobe3535535Qreverse primer31. Polymerisation5355352. Strand displacementRQ3535RQ535

10、3. Cleavage53553354. Polymerisation completedR = ReporterQ = Quencher40数量关系TaqMan 探针上游引物RQ3553下游引物RQ35531. 每产生一条DNA链，就切断一条探针2. 每切断一条探针，就产生一个单位信号3. 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比41差别1个碱基的分辨力 实验成功的关键：Allele 2 (配对)FAM不配对探针的稳定性 探针越长，TAMRA不配对探针越稳定 降低/消除非特异杂交Allele 1 (不配)FAM显著提高实验重现性TAMRA HOW?MGB Probes42TaqMan MGB探

11、针(non-fluorescent quencher) NFQQRAGGCCTTGAGAGATATMGB(minor groove binder)RQAGGCCTTGAGAGATAT|GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACAC43Tm enhancerNFQQR3MGB5Minor Groove Binder (MGB Probe)Minor Groove Binder attached at 3 end of probeMore potent than propynl substitutionsAll probes will be short (13-20-mers

12、) 提高Tm提高信噪比 无背景荧光 更好的淬灭效果(15 mer 提高 18C) 探针更短 更多重的PCRT or Mismatch ProbemStabilizationTAMRAMGBTm=65Tm=65Tm=59Tm=49(Tm = 6C)(Tm = 17C)70C65C60C55C50C T = T of perfectly matched probe - T of mismatchedmmm Discrimination of alleles is achieved by using an annealing/extension temperature within the Tm w

13、indow45两种探针效果比较TAMRA probe 38-mer:ACTTTTCTGTAAGTAGATATAACTTTTCAAAAAGACAGCTGTAAGTAGATATAACMGB probe 17-mer:1.41.21.00.80.60.4MGBTAMRA0.20.0051015202530354046Cycle NumberTaqMan探针的其他衍生形式分子信标(Molecular beacon)47杂交双探针变 性退 火延 伸完 成48探针法的优点灵敏而且特异PCR灵敏+ 探针杂交特异，优势结合测定起始浓度，非终产物浓度每循环采集数据，实时显示，实现CT值定量FAMROXRn =4

14、9TaqMan chemistry的优点Noiseless data 特异性高due to the second level of specificity provided by the probeMultiplex compatible 多重基因定量each probe can be differently coloured and thereby mixed with othersSignal proportional to product荧光强度正比于产物signal related to amount of amplified product (not mass/length)不可逆反

15、应 信号生成后不会自动淬灭other probe chemistries use reversible hybridisation to generate signal50SYBR Green I是一种DNA小沟结合染料与DNA结合时发光游离时不发光51SYBR Green I在PCR过程中染料与DNA结合发光聚合开始聚合完成52数量关系1. 每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去2. 染料一结合，就产生荧光信号3. 信号强度与DNA分子总数目成正比53染料法的长处和短处成本低不需要探针最适合初步筛查先用SYBR筛查，需要时再用TaqMan精确定量熔解曲线功能确定PCR生成几种產物、

16、有无引物二聚体无法多重检测只能检测单一模板无模板特异性只能给出总信号灵敏度低难以准确测定低拷贝数的模板54熔解曲线(Dissociation curve)只有染料法才能做熔解曲线原始数据导数图谱55熔解曲线 引物二聚体分析* 确认非特异性产物是否引物二聚体* 如果是引物二聚体: 优化引物浓度56多重定量多重荧光定量 原 理同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因使用不同的探针识别探针标记不同的颜色。 特 点一次处理样品、一次反应同时给出多种基因或病原体定量检测结果不同扩增体系的信号相互无干扰58多重荧光定量目标基因1目标基因259多色荧光技术 荧光定量需要ROX校正和IPC校正 检材和对照可以

17、在同一管中定量 仪器须有多荧光检测能力 只有ABI，才有4-5色检测能力 FAM VIC TAMRA ROX目的基因第二个目的基因或者IPC淬灭基团参比荧光60ABI Prism 荧光染料功能分类Reporter dye : 6-FAM 、VIC、TET、NEDQuencher dye: TAMRA (常规TaqMan探针)Dark Quencher (MGB Probe)Reference dye: ROX- passive internal reference for signal normalisation- allows relative (not absolute) fluoresc

18、ence to be measured- critical for precision61多重荧光定量数据Cy5FAMNEDVIC62荧光PCR小结z 几十个拷贝/单细胞的检测限：灵敏度高z 特异性强：探针杂交技术z 更快拿到结果：没有后处理，仪器自动分析z 不受污染干扰：闭管操作、dUTP-UNG酶防污染系统z 起点定量：实时扩增数据z 无须稀释样品：定量范围宽达9个数量级z 降低成本：一管多检 、校正误差63等位基因鉴定原理两条探针 正常与突变野生型(wt)突变型(mut) SNP placed in the center of the probe Quencher; TAMRA or M

19、GB/NFQ*65终点结果2/2纯合子实时结果1/1纯合子1/2 杂合子空白对照66定量PCR基本过程定量PCR实验基本流程1. 准备模板(DNA或RNA)2. 加试剂(模板+引物+PCR试剂）3. 填样品表（样品名、孔位）4. 设置参数（探针、颜色、循环）5. 运行PCR6. 数据分析68PCR热循环参数Taq 激活UNG灭活2-步PCRUNG激活69等位基因鉴定实验基本流程PCR试剂+ 引物探针+ 2 ng样品SetupCycle(TaqMan Assay)42 x 384-well blocks every 1.5 hrsABI PRISM 7900HT SDSwith integrat

20、ed roboticsReadAnalyze10,000 genotypes/hour70ABI定量PCR仪大家族ABI荧光定量PCR仪大家族第一代：7700和57007700 ：4色5700 ：单色72ABI荧光定量PCR仪大家族第二代：7000和79007000 ：中小规模7900 ：高通量、自动化73ABI荧光定量PCR仪大家族第三代：7300和75007300 ：低价格、三重定量7500 ：5色检测、快速模式74共同的性能特点9个数量级1倍分辨率熔解曲线试验基因表达软件75仪器构造及性能7300 & 7500构造：门777300 & 7500构造：门 New Door and Plat

21、e Loading Manual Plate Loading Push Push Latch System 反应板机械卡牢 Block Cleaning Position关开清洁787300 & 7500构造：灯 新型卤钨激发灯 额定寿命 2,000 小时 仪器监控灯的寿命，提醒换灯或评估寿命 更换方便，用户操作797000光路系统LampExcitationFilterFold MirrorCCDCameraDichroicMirrorFresnel LensMulti-ElementLensWellLensesFilter Wheel96-Well Plate80“real-time PC

22、R”lenscapPCR vesselthermal blocksample81实时收集PCR数据PCR product accumulation is detectedthroughout the amplification process.0.40.350.30.250.20.150.1cycle 24cycle 25cycle 26cycle 27Cycle Number827000：4色荧光FAM/SYBRVIC/JOETAMRAROXGreen I报告荧光1/染料报告荧光2淬灭荧光参比荧光7900：4色荧光FAM/SYBRVIC/JOENED/TAMRAROXGreen I报告荧光1

23、/染料报告荧光2报告/淬灭荧光参比荧光837300：4色荧光 FAM / SYBR Green I VIC / JOE TAMRA / NED ROX (参比荧光passive reference)7500：5色荧光 5 片激发滤色片、5片发射滤色片 FAM, SYBR Green I VIC, JOE NED, TAMRA, CY3 Dye ROX (passive reference), Texas Red CY5 Dye 增加荧光无须硬件变动：多重荧光解析算法软件847300 热循环 最新一代半导体技术 支持 测试最大反应体积 = 100 uL 测试最小反应体积 = 25 uL 96-孔

24、标准光学反应板 盖膜 无需Compression Pad 0.2 mL 离心管 8连管盖、单盖、平顶盖 固定升降温速率 +/- 1.1oC/sec Dissociation Curve Ramping857500 热循环 高速模式 显著缩短实时定量PCR运行时间 升级/降级需工程师安装 可控升降温速率 标准Thermal Cycler支持 测试最大体积 = 100 uL 测试最小体积 = 25 uL 96-孔标准光学反应板 盖膜 熔解曲线升温 标准9700模式 仿真9600模式 无需CompressionPad 0.2 mL 离心管 8连管盖 单盖 平顶盖86仪器软件系统Software887

25、300 & 7500 SystemsSequence Detection Software v1.2 Improved Usability 绝对定量Absolute Quantification(AQ) Auto Threshold Auto Baseline 相对定量Relative Quantification (RQ) RQ Plate RQ Study containing max of 10 RQ Plates Free for 7500 Customers Only 基因分型Allelic Discrimination (AD) Autocall 阴阳性鉴定Plus/Minus w

26、ith IPC (+/-)897300 & 7500Sequence Detection Software v1.2 Improved Usability Features 反应板（样品表）设置向导 鼠标指向扩增曲线和AD图谱显示well ID 实时显示扩增曲线 卤钨灯寿命监控90Sequence Detection Software v1.2Plate Set Up Wizard -AQ91Sequence Detection Software v1.2Plate Set Up Wizard - AQ92Sequence Detection Software v1.2Thermal Profile93Sequence Detection Software v1.2Software Results - Spectra View94Sequence Detection Software v1.2Results - Amplification Plot95Sequence Detection Software v1.