糖链的序列测定-高碘酸氧化法及Smith降解法

1、 糖链的序列测定一高碘酸氧化法及Smith降解法实验生化分子糖链的序列测定高碘酸氧化法( HYPERLINK /experiment/15-1655-1.html /experiment/15-1655-1.html)高碘酸氧化和Smith降解高碘酸可选择性断裂糖分子中的邻二羟基或邻三羟基处,生成相应的多糖醛,甲醛或甲酸反应定量进行,每开裂1个CC键消耗1分子高碘酸通过测定高碘酸的消耗量及甲酸的释放量,可以判断糖苷键的位置,直链多糖的聚合度,分支多糖的分支数等.Smith降解是将高碘酸氧化产物还原后酸水解，再鉴定水解产物，从而推断糖苷键的位置与分支点等.以葡萄糖为例，以12或14位键合的糖基经

2、高碘酸氧化,平均每个糖基消耗1分子高碘酸,且无甲酸释放;13位键合的糖基不被高碘酸氧化;16位键合的糖基或非还原末端糖基经高碘酸氧化,消耗2分子高碘酸同时释放1分子甲酸.【实验原理】高碘酸可以选择性地氧化和断裂糖分子中连二羟基或连三羟基处，生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。反应定量地进行，每开裂一个C-C键消耗一分子高碘酸。通过测定高碘酸消耗量及甲酸的释放量，可以判断多糖分子中糖苷键的位置、类型、多糖的分枝数目和取代情况等。【实验材料】实验器材紫外分光光度计。实验试剂溴甲酚蓝指示剂：0.1克溴甲酚蓝溶于250ml蒸馏水中(含1.43毫升0.1mol/L氢氧化钠)。30mmol/L高碘酸钠溶液。高碘

3、酸钠基本信息中文名称：高碘酸钠英文名称:Sodiumperiodate中文别名：过碘酸钠;偏高碘酸钠英文另0名：SodiumMetaperiodate;SodiumMetapriodate;Sodium(Meta)Periodate;SodiumTetroxoiodate(Vii);SodiummetaperiodateCAS:7790-28-51EINECS:232-197-6分子式:NaI04分子量:213.8918高碘酸简介中文名称：高碘酸英文名称：periodicacid正高碘酸英文另0名:pentahydroxy-lambda5-iodaneoxide1CASNo.:10450-60

4、-9分子式：H5IO6分子量：227.94理化特性：主要成分：纯品外观与性状：无色或白色结晶，无臭，有潮解性熔点(C):122沸点(C):140(分解)相对蒸气密度(空气=1):7.9溶解性:溶于水、乙醇，微溶于乙醚主要用途：用作氧化剂。高碘酸钠制备：氯气氧化法将碘在水介质中，通入氯气进行氧化生成高碘酸，经分离杂质后，加入氢氧化钠溶液中和至pH23，生成高碘酸钠溶液，再经提纯、分离杂质、蒸发浓缩、冷却结晶、离心分离、干燥，制得高碘酸钠成品，其反应方程式：HIO4+NaOHNaIO4+H2O乙二醇。(4)0.01mol/L氢氧化钠溶液。【实验操作】1.制作标准曲线：取6支干燥试管，按下表操作管号

5、012345高碘酸钠(ml)00.51.01.52.04.0蒸馏水（ml）4.03.53.02.52.00各取0.1ml，定容至25ml,在223nm处测定光密度A223横坐标为高碘酸钠毫摩尔数，纵坐标为光密度值，绘制标准曲线。2.样品测定称取多糖样品25mg，用少量水溶解，加入30mmol/L高碘酸钠溶液，定容至25ml，置于暗处，室温下进行反应，于0,6,12,24,36,48.小时间隔取样0.1ml,蒸馏水稀释250倍后，使用紫外分光光度计在223nm处测定光密度。至光密度值达一稳定值时，加乙二醇破坏过量的高碘酸以终止反应。由此光密度值根据标准曲线计算出高碘酸的消耗量。取2ml上述反应溶

6、液，测定甲酸的生成量。剩余部分进行Smith降解。3.甲酸测定：取2ml上述反应溶液，加一滴溴甲酚蓝作指示剂，用0.01mol/L氢氧化钠溶液滴定甲酸的释放量。【注意事项】为避免发生超氧化，反应溶液的pH值应控制在35,而且一定要在低温、避光处进行实验生化分子糖链的序列测定一Smith降解法( HYPERLINK /experiment/15-1657-1.html /experiment/15-1657-1.html)Smith降解是将高碘酸氧化产物用硼氢化合物（如硼氢化钾或硼氢化钠）还原成稳定的多羟基化合物。然后进行适度的酸水解，用纸层析鉴定水解产物，由水解产物可以推断多糖各组分的连接方式

7、及次序。以葡聚糖为例，其反应式如下图：以1-2位键合的糖基经高碘酸氧化，平均每个糖基仅消Smith降解是将高碘酸氧化产物用硼氢化合物（如硼氢化钾或硼氢化钠）还原成稳定的多羟基化合物。然后进行适度的酸水解，用纸层析鉴定水解产物，由水解产物可以推断多糖各组壬12、3iwssl$l、8Smith霸讪巾ni苗。:171=&辟|311wwwQCTi口hmmAtiffibV并曹淵料然富矗WWW-_-nlbl壬13iosssnSmithCM止uot宀呛HQHyq-IATFOXGrol常爲寻卩U3 OHH2OHO!OH+CH2OHHOHOH牛料n衣多=：殳念井页j圉iXiAii.riAi.bbiOD.匚口EK

8、BHOHCH,OHo以1-6位键和的糖基或非还原末端基(1-6)经高碘酸氧化，消耗二分子高碘酸，同时释放一分子甲酸；Smith降解后产生甘油。叩.OHOHOCHO+CH2OHOKBH务CH2OHOHCO.H+甘油+乙二醇OHOTJHCOOHOHjOflJKB?O.sOHCH1OHHOHjOCblrOHCHOHCHaOH本实验通过纸层析检测终产物中的甘油、赤藓醇和糖。【实验材料】0.1mol/L醋酸。2mol/L硫酸。硼氢化钾。纸层析试剂及器材：除显色剂外，同实验二。硝酸银显色剂：A:16%硝酸银水溶液：丙酮为1:9(V/V)。B:1%NaOH乙醇溶液(W/V)。C：6mol/L氢氧化铵。【实验操作】1.还原和水解高碘酸氧化后经乙二醇处理的溶液对流水透析48小时，蒸馏水透析24小时，于40C以下减压浓缩至10ml左右，加入70mg硼氢化钾于室温、暗处搅拌18小时24小时以还原多糖醛。用0.1mol/L醋酸中和至pH67，对流水透析48小时，蒸馏水透析24小时，减压蒸干，加1mol/L硫酸2ml,封管，100C水解8小时，用碳酸钡粉末中和，定量滤纸过滤，滤液减压浓缩后，通过纸层析方法检测。2.纸层析操