聚丙烯酰胺凝胶电泳

1、关于聚丙烯酰胺凝胶电泳第一张，PPT共三十页，创作于2022年6月 一、PAG 的 组成 PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）单体和N，N-亚甲双丙烯酰胺（N，N，N，N-methylene bixacrylamide，Bis）交联剂通过自由基聚合而成的一种多孔三维网状结构。Acr + Bis 多孔三维网状结构 第二张，PPT共三十页，创作于2022年6月（1）丙烯酰胺结构式第三张，PPT共三十页，创作于2022年6月（2）亚甲双丙烯酰胺第四张，PPT共三十页，创作于2022年6月第五张，PPT共三十页，创作于2022年6月 二、PAG 的 聚 合 需要催化剂氧化还原系统作用，使

2、Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。 第六张，PPT共三十页，创作于2022年6月 （一）化学聚合：AP-TEMED系统 过硫酸胺(NH4)2S2O8（Ammonium persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。 第七张，PPT共三十页，创作于2022年6月 AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42- 。注意： TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧 升高温度

3、能提高聚合，降低温度能延迟聚合第八张，PPT共三十页，创作于2022年6月 （二）光聚合：核黄素-TEMED系统核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。注意：分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。第九张，PPT共三十页，创作于2022年6月 三、PAG的浓度与孔径的关系 PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。Acr

4、/Bis：2040 完全透明且有弹性； 10 很脆，易碎，不透明； 100 糊状不成形，易破碎。第十张，PPT共三十页，创作于2022年6月 凝胶总浓度T100ml凝胶溶液中含有Acr和 Bis的总克数。T=（a+b）/m100% T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。 T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。 第十一张，PPT共三十页，创作于2022年6月CBis占单体与交联剂总量的百分比。C=b/（a+b）100%当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。第十二张，PPT共三十页，创作于2022年6月 四、不 连 续 PAGE 按具体操作分 垂直板形电泳 圆盘电泳按凝胶

5、系统的均匀性分 连续PAGE 不连续PAGE 第十三张，PPT共三十页，创作于2022年6月 Disc成分 作用样品胶 T=3% C=20%单体欲分离的样品溶液pH6.7 Tris-HCl缓冲液混在一起，用光聚合方法聚合而成的大孔凝胶有防对流作用 电极槽缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液第十四张，PPT共三十页，创作于2022年6月 Disc成分 作用浓缩胶除不加样品外，其余组成成分同样品胶相同样品在此胶中被浓缩 第十五张，PPT共三十页，创作于2022年6月 Disc成分 作用分离胶 T=7%C=2.5%单体溶液pH8.9 Tris-HCl缓冲液化学聚合法聚合成小孔胶主要的电泳分

6、离部分 第十六张，PPT共三十页，创作于2022年6月 分 离 原 理1. 浓缩效应1）凝胶层的不连续性 两层凝胶T与C不同孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。 第十七张，PPT共三十页，创作于2022年6月 2）缓冲液离子成分的不连续性甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离度（）很小，有效迁移率（M ）很低，移动速度较慢，称为慢离子。HCl 是强电解质，=1，Cl-有效迁移率大，移动速度快，称快离子。蛋白质（pI6.0）带负电荷，有效迁移率介于两者之间。 第十八张，PPT共三十页，创作于2

7、022年6月pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液甘氨酸HCl蛋白质样品胶浓缩胶分离胶样品低电导区第十九张，PPT共三十页，创作于2022年6月 3）pH值的不连续性 为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间pH值有所区别。第二十张，PPT共三十页，创作于2022年6月 3.分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后，Gly-成为快离子 分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离第二十一张，PPT共三十页，创作于2022年6月第二十二张，PPT共三十页，创作于2022年6月第二十三张，PPT共三十页，创作于2022年6月第二十四张，PPT共三

8、十页，创作于2022年6月第二十五张，PPT共三十页，创作于2022年6月 五、PAGE 的 特 点1.具有分子筛效应，分辨率高2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明6.网孔可调节 第二十六张，PPT共三十页，创作于2022年6月 小 结1.掌握（不连续）PAGE的原理2.掌握影响PAGE迁移率的因素3.掌握PAGE的操作注意点、试剂作用4.熟悉PAG的聚合第二十七张，PPT共三十页，创作于2022年6月思 考 题名词解释1.凝胶总浓度2.凝胶交联度问答题1.与CAM