杯芳烃类化合物的设计合成及在药物载体与抗肿瘤药物研究中的应用

1、杯芳烃类化合物的设计合成及在药物载体与抗肿瘤药物研究中的应用杯芳烃 (Calixarenes) 是一类由对叔丁基苯酚与甲醛通过酚醛缩合反应生成的超分子大环化合物 , 具有外疏水内亲水的可变空腔结构, 易于化学修饰, 且在体内不会引起免疫反应等优点 , 是继环糊精和冠醚的第三代超分子化合物。在杯芳烃的上缘或下缘通过功能化修饰引入特定基团 , 可得到具有良好水溶性或生物活性的杯芳烃衍生物 , 用于难溶于水药物的载体(Drugcarriers) 及抗肿瘤超分子药物 (Anti-tumordrugs) 的研究 , 在生物医学领域具有明显的优势和广阔的应用前景。基于上述研究意义, 本论文以对叔丁基杯n

2、芳烃 (n = 4,6,8) 及单氧杂二同杯 4 芳烃为母体骨架, 运用药物设计原理, 通过功能化修饰引入特定的活性基团设计合成了多个系列羧酸类、酰胺类衍生物 , 并根据引入基团的功能差异分别开展载药性能、抗肿瘤活性及作用模式的理论计算研究, 取得了一些较有意义的实验成果。本研究开发了新型杯芳烃类抗肿瘤药物及载体, 同时开辟了杯芳烃在药学应用的新途径。论文主要分为以下五部分:1. 功能杯芳烃类衍生物的设计与合成以对叔丁基苯酚和多聚甲醛为起始原料, 控制反应条件, 采用一步合成法, 制备对叔丁基杯芳烃母体 , 进一步通过逆傅- 克、酯化、水解反应等获得双亲性杯芳烃羧酸衍生物 ,用于抗肿瘤药物紫杉

3、醇的包合和纳米载药体系的构建。在查阅文献的基础上, 采用药物拼接原理, 将杯 4 芳烃母核与乙醇胺拼接, 通过改变其空腔大小 , 在杯芳烃下缘引入链长不等的多羟基氨基及对杯芳烃上缘进行修饰等药物改造方法, 进行了杯芳烃多羟基胺类抗肿瘤药物的设计。分别以对叔丁基杯n 芳烃 (n= 4,6,8) 为母体酯化、氨解反应最终获得13个新型杯n芳姓:多羟基胺衍生物3a-3m;讨论了反应条件对目标产物收率的影响。上述目标产物的结构均采用IR、1H NMR 13CNMRHR-M邻进行了表征。成功获得 3a 的单晶并利用单晶衍射明确其构型。 以杯 4 芳烃乙醇胺衍生物3a 为先导化合物 , 运用药物设计的基本

4、方法, 进行药物改造设计, 即通过改变母体骨架，将杯4芳姓:桥上的一个亚甲基替换为CH2OCH鬻到单氧杂二同杯4芳烃母体骨架, 在下缘引入数目及性能不同的基团。以对叔丁基单氧杂二同杯4 芳烃母体 , 通过酯化、水解, 并控制反应条件分别得到单取代,1,3- 二酯类和酸类中间体, 进一步与乙醇胺、 芳香胺、 氨甲基吡啶等反应获得CA系列、DA系列、DA2系列单氧杂二同杯4芳姓:单取代和二取代酰胺衍生物 27 个; 以氧杂二同杯4 芳烃为母体 , 与 1,2- 二溴乙烷在不同的体系中进行亲核取代反应获得EA系列乙撑基桥联衍生物3个。上述目标产物的结构采用IR、1H NMR 13C NMR HR-M

5、野进行了表征并确证。成功获得 CA-11、 EA-1、 EA-2、 EA-3 的单晶 , 并利用单晶衍射明确其构型。2. 杯芳烃羧酸衍生物对紫杉醇的包合及纳米载药体系的构建利用紫外、 荧光光谱法研究杯芳姓:竣酸衍生物C8OCA寸水溶性较差的紫杉醇抗月中瘤药物的包合作用， 考察了二者摩尔比、温度等因素对包合作用的影响。结果显示C8OCAS一定条件下与紫杉醇可形成稳定的超分子包合物。采用透 析法成功制得杯6、杯8芳姓:竣酸纳米粒(CnCA NPs),其平均直径为180-220 nm,呈规则球形，具有负电荷大于-30 mV。进一步构建PTX-CnCANPs载药体系，结果表明C6HCANPs和C8OC

6、ANPs具有 良好的负载紫杉醇(PTX) 的能力 , 载药量分别为7.5%和 8.3%。体外释放实验结果结果表明C6HCA NPst匕C8OCA NP糅放速率稍快。前者在 30 min 内可达到33.7%,在 4 h,8 h,24 h, 累积释放药物百分比可达到57.5%,73.8%和96.2%。CnCANP的这些良好特性使它们有可能成为潜在的月中 瘤靶向给药纳米载体。3杯n芳烂多羟基胺类衍生物的体外抗月中瘤活性评价采用MTM SRBt研究了 13个杯n芳姓:(n = 4,6,8)多羟基胺衍生物3a-3m对A549SKOV3SW1990 HeLa Raji和MDA-MB-2310中瘤细胞白单浓

7、度(10NM)抑制活性作用。结果表明 目标化合物 3a-3m 对上述肿瘤细胞具有不同程度的抑制活性作用 , 其中杯 4 芳 烃多羟基胺衍生物对肿瘤细胞的抑制活性最佳, 杯 8 多羟基胺衍生物基本没有任何抑制活性。初步的构效关系表明杯芳烃空腔较小、上缘有叔丁基, 下缘引入链长较短的乙醇氨基时, 有利于其抑制肿瘤活性。 这可能和杯芳烃的空腔大小、 上缘叔丁基、下缘酚羟基及新引入基团的数目、极性和亲水性有关。进一步开展了 3a-3d 对肿瘤细胞的多浓度抑制测试,3a-3d 的 IC50 值在1.611.3仙M其中,3a和3b对SKOV3g胞的抑制活性作用最好。采用流式和免疫荧光染色术进一步研究其肿瘤

8、凋亡机制。 流式实验结果表明3a能引起SKOV3g胞周期在G0/G1期阻滞。免疫荧光染色实验结果表明，SKOV3ffl胞中caspase-3和p53蛋白水平明显 升高 , 而 Bcl-2 水平则明显下降, 同时 Bax 水平无明显变化。4. 单氧杂二同杯4芳烃酰胺类衍生物的体外抗肿瘤活性评价通过体外细胞增值抑制实验研究单氧杂二同4芳姓:酰胺类衍生物在10 nM给药浓度下对A549 SKOV3MCF-7 Hela、HepG2?月中瘤细胞的单浓度抑制活性作用并与先导化合物3a进行对比，从引入活性基团的空间位阻, 极性、亲水性等角度总结其可能的构效关系。结果表明 , 上述化合物对肿瘤细胞呈现不同程度

9、的抑制作用。目标化合物CA-10、CA-11与3a对月中瘤细胞的抑制作用相当,且对正常细胞的杀伤作用较小。引入氨甲基吡啶基团 , 抑制肿瘤活性提高 ; 引入芳香胺, 则降低甚至没有任何作用。CA-10对月中瘤细胞增殖白抑制作用最佳,其IC50在2.19.6 M进一步通过流式实验技术初步研究其对MCF细胞周期和细胞凋亡的影响,流式实验结果表明单氧杂二同杯4芳姓:酰胺CA-10能引起MCF-7细胞周期在 G0/G1期阻滞，但肿瘤细胞没有明显凋亡，由此可以推断CA-10可能是通过将 MCF-7细胞周期阻滞在G0/G1期，从而达到抑制月中瘤增殖的作用。今后将进一步 探索单氧杂二同杯4 芳烃酰胺类衍生物

10、的抗肿瘤作用机制 , 为杯芳烃抗肿瘤药物的研究奠定基础。5.杯芳烧类超分子化合物的量子化学计算及分子对接采用 DFT计算法研究 了杯芳烧竣酸衍生物与紫杉醇（PTX）相互作用模式。通过NBO算形成的络合物 空间和相互作用力及能量。计算结果表明 , 主客体分子间的静电作用以及包括氢键和范德华力在内的非共价相互作用，是其包裹络合过程的主要驱动力，也是杯8芳烂C8OC滕为潜在 的紫杉醇载体的重要保证。采用 Sybyl-X2.1 中的 Surflex 分子对接模块研究化合物杯4芳姓:乙醇胺衍生物3a与靶点VEGFR2能的相互作用模式，取分子对接 打分最高值的构象为化合物 3a 的结合模型。分子对接结果表明，化合物3a可对接到VEGF-R2勺ATP结合位点区域，