药监系统官方培训 2020年版中国药典四部 微生物限度检查及无菌检查

1、2020年版中国药典四部微生物限度检查及无菌检查 微生物限度检查培养基适用性检查无菌检查答疑实验室环境要求概要一、微生物实验室环境 一、实验室的设施与环境管理 功能区域要求 总体要求：各功能区域应明确标识，特别是菌种储藏室、污染物处理区、阳性菌室等存在生物安全危害的区域。一、实验室的设施与环境管理 功能区域要求 洁净室要求：洁净室作为药品微生物实验室的核心区域，应远离交通干道、厕所及污染区，应选上、下水道及其他安装适宜的位置。洁净室与各配套功能区，包括清洗、培养基配制、消毒/灭菌、灭菌物品存放和传输、培养区域、结果观察、试验菌实验和办公室等，要集中，减少污染，便于管理和使用。空气机组或空气净化

2、系统：洁净或无菌室应配备独立的空气机组或空气净化系统，定期更换并保存记录。洁净区 、活菌操作区：在时间或空间上有效分隔不相容的实验活动。活菌操作区：配备生物安全柜；病原微生物的分离鉴定工作在二级生物安全实验室进行。一、实验室的设施与环境管理 功能区域要求洁净实验室（环境监测）：各洁净级别空气悬浮粒子的标准 （通则9205表3）洁净度级别悬浮粒子最大允许数 / 立方米静态动态0.5m5.0m0.5m5.0mA 级352020352020B 级3520293520002900C 级3520002900352000029000D 级352000029000不作规定不作规定一、实验室的设施与环境管理

3、功能区域要求无菌检查应在B级背景下的A级单层流洁净区域或隔离系统中进行。微生物限度检查应在不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进行洁净度级别表面微生物A级1111B级10555C级1005025D级20010050一、实验室的设施与环境管理 功能区域要求各洁净级别物理参数建议标准（通则9205表1）洁净度级别过滤完整性气流组织空气流速换气次数压差温度相对湿度A级检漏试验监测周期24个月单向流监测周期24个月0.25-0.50 m/s监测周期12个月-洁净区与非洁净区之间压差不小于10Pa;不同级别洁净区之间的压差不小于10Pa监测周期每周一次20-24监测周期每次实验45-65%监测周期每次

4、实验B 级单向流 （静态）监测周期24个月非单向流 -单向流(静态 )0.25-0.50m/s监测周期12个月非单向流 - 单向流-非单向流 -140-60h监测周期12个月C 级非单向流 - -120-40h监测周期12个月D 级非单向流 - -16-20 h监测周期12个月一、实验室的设施与环境管理 功能区域要求推荐的药品洁净实验室的监测频次及监测项目通则（9205表2）受控区域采样频次监测项目无菌隔离系统内部每次实验空气悬浮粒子 、浮游菌或沉降菌 、表面微生物（含手套）外部每半年一次空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物微生物洁净实验室A 级每次实验空气悬浮粒子 、浮游菌、沉降菌 、表

5、面微生物（含手套及操作服）B 级每周一次空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物（含手套及操作服）C 级每季度一次空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物D 级每半年一次空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物一、实验室的设施与环境管理 功能区域要求生物安全实验室（BSL-2)：一、实验室的设施与环境管理 功能区域要求 实验室应建立洁净室（区）和隔离系统的验证、使用和清洁维护标准操作规程，对可能影响检测结果的工作（如洁净度验证及监测、消毒、清洁维护等）能够有效地控制、监测并记录。实验室对所用的消毒剂应进行效力验证并定期更换，消毒剂在使用前应尽可能使用0.22m的无菌滤膜进行除菌过滤。一、实验室

6、的设施与环境管理 功能区域要求无菌取样的环境无菌取样应在无菌实验室内进行，特别是采用无菌生产的产品，应有非常严格的无菌防护措施，避免在抽样过程中造成微生物的污染。如果可能，所有的样品包括非灭菌样品均应在具有无菌条件的特定抽样间进行无菌抽样。一、实验室的设施与环境管理 功能区域要求无菌洁净室的运行 建立使用登记制度 按洁净室管理规范的要求制立SOP（开启运行、人员进入程序、日常监测、UV灯与过滤器定期更换等） 定期再验证管理与环境监测计划一、实验室的设施与环境管理 功能区域要求环境的清洁、消毒所用清洁、消毒剂的种类和使用规定规定清洁、消毒的频次、方法；（每次试验/或每日、每周、每月等）建立清洁、

7、消毒记录；实验室对所用的消毒剂种类应定期更换，使用的消毒剂应无菌。二、培养基适用性检查 二、培养基适用性检查微生物限度检查1.计数培养基的适用性检查：验证菌： TSA：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉、 白色念珠菌 SDA：黑曲霉、白色念珠菌验证菌加入量：不大于100cfu培养基：待检培养基、标准培养基方法：注皿法培养条件：TSA：3035，不超过3天 SDA：2025，不超过5天 促生长能力： 液体培养基：分别在待检培养基和标准培养基中加入目标菌。 固体培养基：涂布法，不大于100cfu抑制能力： 大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌对应的对照菌是金黄色葡萄球菌；金黄色葡萄球菌

8、对应的对照菌是大肠埃希菌； 溴化十六烷三甲胺琼脂培养基和念珠菌显色的对照菌是大肠埃希菌控制菌的培养基实用性检查指示能力：指示能力：耐胆盐革兰阴性菌：紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基大肠埃希菌和铜绿假单胞菌大肠埃希菌：麦康凯琼脂培养基沙门菌：木糖醇赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基和三糖铁琼脂培养基 金黄色葡萄球菌：甘露醇氯化钠琼脂培养基白色念珠菌：沙氏葡萄糖琼脂培养基和念珠菌显色培养基 二、培养基适用性检查无菌检查无菌性检查每批培养基随机抽取5瓶（支），各置相应规定温度培养14天，应无菌生长。培养基灵敏度检查1.硫乙醇酸盐流体培养基的适用性检查：验证菌： 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌验证菌加入量：不

9、大于100cfu培养基量：12ml方法：直接接种法培养条件：3035，不超过3天 2.胰酪大豆胨液体培养基的适用性检查：验证菌： 枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉验证菌加入量：不大于100cfu培养基量：9ml方法：直接接种法培养条件：2025，不超过5天三、微生物限度检查 计数方法适用性检查1.供试液的制备 水溶性供试品 非水溶性供试品：可适量加入如聚山梨酯80等表面活性剂，加入量及加入的试剂均需进行验证，以证明其无明显抑菌性。 油性供试品：十四烷酸异丙酯或其它无抑菌性的表面活性剂。 肠溶供试品：一般肠溶制剂用pH6.8磷酸盐缓冲液，结肠制剂用pH7.6磷酸盐缓冲液。 膜剂、贴膏剂：浸泡或振

10、摇30分钟气雾剂：在-20冷冻1小时候，将抛射剂完全放出后，再进行试验。2.稀释和接种菌液对照组稀释液+菌液菌液的加入体积不超过1%最终菌液浓度为小于100cfu/ml供试品对照组供试液+稀释液稀释液的加入体积不超过1%试验组供试液+菌液菌液的加入体积不超过1%最终菌液浓度为小于100cfu/ml计数方法适用性检查示意图菌液组 H B K T J 稀释液0.1ml菌液稀释液需氧菌总数胰酪大豆胨琼脂培养基霉菌和酵母菌菌总数沙氏葡萄糖琼脂培养基计数方法适用性检查示意图试验组 H B K T J 1:10供试液0.1ml菌液1:10供试液需氧菌总数胰酪大豆胨琼脂培养基霉菌和酵母菌菌总数沙氏葡萄糖琼脂

11、培养基计数方法适用性检查示意图供试品对照组 10ml 供试液1:10供试液0.1ml稀释液需氧菌总数胰酪大豆胨琼脂培养基霉菌和酵母菌菌总数沙氏葡萄糖琼脂培养基 稀释级的选择： 固体制剂：1:10的供试液 液体制剂：供试品原液微生物回收的方法： 倾注法：供试液1ml注入平皿中 涂布法：供试液不少于0.1ml3.抗菌活性的消除增加稀释剂的量： 稀释倍数应低于该品种微生物限度标准增加培养基的体积： 可采用大皿，例如150mm的平皿加入适量的中和剂： 如聚山梨酯80，硫代硫酸钠等薄膜过滤法： 对于无抑菌性的供试品，可在供试液中直接加入目标 菌后进行薄膜过滤；对于有抑菌性的供试液，可先进行薄膜过 滤，最

12、后一次冲洗液中加入目标菌。每张滤膜每次冲洗量一 般为100ml，冲洗总量不得超过1000ml. MPN法：仅用于需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下 九管法：连续3个稀释级，取1ml供试液接种于910ml胰酪大豆胨液体培养基，每级制备3份，置3035培养3天，观察是否有微生物生长，查微生物最可能检索表，得到供试品需氧菌总数的最可能数。控制菌方法适用性供试品组：相当于1g或1ml的供试液阳性对照组：相当于1g或1ml的供试液+不大于100cfu的目标菌阴性对照组：与供试液同体积的稀释液耐胆盐格兰阴性菌检查1.供试液制备和预培养：取供试品10g，加胰酪大豆胨液体培养基至100ml，放置2025培养约

13、2小时内。2.定性试验：取1:10的供试液10ml，加至肠道菌增菌培养基中（加入量应经过验证），此方法适用于标准为不得检出的供试品。3.定量试验：三管法，同上述MPN法，每级稀释级均取1ml加入一管培养基中。4.选择与分离：取上述培养物划线于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上。5.结果判断：若紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长，定性试验判断是否检出；定量试验则对应培养管，查表确定供试品中含有耐胆盐格兰阴性菌的可能菌数。大肠埃希菌检查增菌培养：1:10的供试液接种至胰酪大豆胨液体培养基中。选择和分离培养：取上述培养物1ml转种至麦康凯液体培养基100ml中，4244培养2448小时，取此培养物划线于麦康凯

14、琼脂平板上。结果判断：如有菌生长，应进行鉴定试验判定是否检出大肠埃希菌。沙门菌检查增菌培养：供试品10g直接接种至胰酪大豆胨液体培养基中。选择和分离培养：取上述培养物0.1ml转种至RV沙门增菌液体培养基10ml中，3035培养1824小时，取此培养物划线于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上。 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上沙门菌菌落形态：淡红色或无色，透明或半透明，中心有或无黑色。 结果判断：如可疑菌落生长，应挑取可以菌落转种于三糖铁琼脂培 养基斜面上。若三糖铁琼脂斜面出现：斜面为红色，底层为黄色斜面及底层均为黄色 黑色 应进行鉴定试验判定是否检出沙门菌，如血清学试验，微生物全自动鉴定系统等。铜

15、绿假单胞菌检查增菌培养：1:10的供试液接种至胰酪大豆胨液体培养基中。选择和分离培养：取上述培养物划线于溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上。溴化十六烷基三甲铵琼脂平板菌落形态：草绿色，扁平，蔓延生长。结果判断：如有可疑菌落生长，进行氧化酶实验，铜绿假单胞菌氧化酶实验阳性。金黄色葡萄球菌检查增菌培养：1:10的供试液接种至胰酪大豆胨液体培养基中。选择和分离培养：取上述培养物划线于甘露醇氯化钠琼脂平板上。甘露醇氯化钠琼脂平板菌落形态：金黄色或黄白色，菌落周围有黄色环。结果判断：如有可疑菌落生长，应进行鉴定试验判定是否金黄色葡萄球菌，常使用血浆凝固酶试验。梭菌检查供试液热处理：取1:10的供试液2份，其中

16、一份置80保温10分钟后迅速冷却。增菌培养：将2份1:10的供试液分别接种至梭菌增菌培养基中。选择和分离培养：取上述培养物少量分别涂布于哥伦比亚琼脂平板上。结果判断：如有可疑菌落生长，应进行过氧化酶试验，如过氧化酶试验阴性，再进行鉴定试验判定是否检出梭菌。白色念珠菌增菌培养：1:10的供试液接种至沙氏葡萄糖液体培养基中。选择和分离培养：取上述培养物划线于沙氏葡萄糖琼脂平板上。沙氏葡萄糖琼脂平板菌落形态：白色，偶见淡黄色，表面光滑，有浓酵母味。结果判断：如有可疑菌落生长，取可疑菌落划线于念珠菌显色平板上。四、无菌检查 四、无菌检查法1.直接接种法2.薄膜过滤法只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法

17、若需要适用表面活性剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。无菌检查(直接接种法）原理示意图 供试液硫乙醇酸盐 1支硫乙醇酸盐10支 TSB 10支培养基30-35 培养3天20-25 培养14天阳性对照菌小于100CFU30-35 培养14天无菌检查(薄膜过滤法）原理示意图 供试液硫乙醇酸盐硫乙醇酸盐 TSB冲洗液培养基30-35 培养14天20-25 培养14天阳性对照菌小于100CFU30-35 培养3天1.稀释液0.1%无菌蛋白胨水溶液 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 稀释液选择原则：根据供试品特性，经过验证的适宜溶液 可在稀释液中加入表面活性剂或中和剂 2.取样量 四、方法适用性检查目的 确认所采用的方法适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以已被充分消除到可以忽略不计。 保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。何时需验证验证时间 建立方法处方发生改变工艺发生改变原检验条件 发生改变 预实验小结实验用品方法学验证 确定的方法 薄膜过滤法验证步骤取规定量直接过滤(