WesternBlot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜

1、Western Blot 技术专辑之 PAGE胶电泳和转膜PAGE 倒胶的仪器我们在前面 WesternBlot 仪器之选已经介绍过了， 除了顺手的工具 能防止漏胶， PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配 胶的比例，在分子克隆上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在 于过硫酸铵（ AP）一定要新鲜最好用小指管配 AP（写日期）保存在 -20 度，超过 2 周的 AP 扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，小气病发作的后果往往是得不偿失胶凝不好多半是这里疏忽（或者混合不匀），因为相对配胶的其他组分， AP 算最活跃 分子如果还有诸如漏加

2、某组分或者配比错误或者 Buffer 搞错，那绝对是你自己找骂， 不值得同情。水要用去离子的纯水， MilliQ 级更好。 Cambrex（ 原来的 FMC）有商品化的丙烯 酰胺母液，很贵，也很好配出的胶对200KD以上的蛋白的分辨率高于普通PAGE胶，条带清晰漂亮， 可惜一直没有搞清楚配方的奥秘； 但是数十倍于丙烯酰胺粉剂的价格令人却步， 不过， 对接触丙烯酰胺粉尘严重过敏的人可以选择这个。 更加豪华的选择是已经凝好的预制 胶，各种配方各种比例各种梳孔大小多少任君选择，打开即用，当然更直接方便，更吸引人 的是结果漂亮，分辨率高，特别是重复性好，条带真正是 razor sharp 啊！平时都能

3、用这 么豪华的东西心情当然超爽啊， 实验紧凑又轻松， 效率也更高啊！ 如果实验都能这么“好马 配好鞍”， 想必更容易出结果， 也就更容易拿经费吧！ 什么时候我们的实验才能实现这种良 性循环啊！ Invitrogen 旗下的 Norvex 和 Cambrex（原来的 FMC） PAGEr都是首选预制胶。可 是在“社会主义初级阶段”这种奢侈品平时流流口水就算了，偏偏最近 Invitrogen 公司推 出了新的优惠活动，买 3 盒 NuPAGE预制胶就送电泳仪或者电转移，面对这种诱惑，你难道 就没有一点非份之想的冲动？上样电泳 ：上样前蛋白样品最好离心， 上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯

4、地 “笑”你贪多嚼不烂哦。其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳 Buffer （别小气，重复使用会降低缓冲能力的），好像基本不会出问题了。当预染的 Marker 告诉 你，你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区分离胶的2/3 处， OK，电泳结束了。电泳结果检查 ：如果要做 Western Blot ，是否需要先检查电泳结果呢？能先看看结果如何 再进行下一步转膜当然最好。 考马斯亮蓝使用简便快速， 可以分辨 1ug 左右的条带， 是最经 济通用的蛋白 PAGE胶电泳染色方法。银染操作复杂一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng蛋白。 可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干

5、扰后面的 Western Blot实验， 很多人会选择省略掉这一步同样的样品跑 2 块胶，一块染色一块转膜， 一般也可 以说明问题。如果想在转膜前看看电泳结果，你需要用SYPROT angerine 这种金色荧光蛋白染料灵敏度很高检测 4ng-8ng 蛋白， 接近银染， 但使用非常简单， 最重要的是由于 不用酸碱或者有机溶剂固定， 不干扰蛋白活性， 特别适合 Western 转膜前的染色， 或者非变 性胶的活性蛋白的检测（比如染色后还需要在胶上进行活性检测等等）。可惜 SYPRO Tangerine 价格挺贵的， 500ul （ 5000 x）要 2000元，即使很节约的用只够大概 100 多

6、次呢。 所以最经济实惠的方法是：丽春红 S，直接染色转移膜，检测转膜效果，充分脱色后不干扰 Western 结果。丽春红的检测灵敏度和考马斯亮蓝差不多。转膜 ：经过 PAGE电泳分离后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤从PAGE胶转移到膜上固定，才能用各种方法进行 Western Blot 的检测和显色，而且为了防止没有电场的情况下 已经分离的蛋白条带扩散， 转移要尽快进行转膜的首要是选膜。 在转移膜上显色其实就像是 画家在画布上作画一样，不光要有好的画笔和颜料，适合的画布也是相当之重要。 Western Blotting 亦是如此，没有选择好合适的转移膜是无法做出漂亮的结果的。因此，选择适合

7、的转移膜，要让转移“膜”高一尺，帮衬而不是阻碍到我们的实验。Western Blot 印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（Nitrocellulose BlottingMembranes， NC）和 PVDF膜（ Polyvinylidene-Fluoride） ，此外也有用尼龙膜、 DEAE纤维素膜做蛋白印迹。 具体哪种膜适合于哪些实验呢？选择的根据主要有： a. 膜与目的蛋白分 子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白 的大小）； b. 不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）； c. 如果后继实验有其他要求， 比如要做蛋白测序

8、或者质谱分析， 还要根据不同目的来挑选不同 的转移膜，就像国画要选择宣纸，油画要挑亚麻布或薄棉扣布一样。首先来比较下这几种膜的特点NC膜尼龙膜PVDF膜灵敏度和分高高高辨率背景低较高低结合能力80 110 ug/cm2400 ug/cm2125 200 ug/cm2（适合于SDS 存在下与蛋白质的结 合）材料质地干的 NC膜易脆软而结实机械强度高溶剂耐受性无无有操作程序缓冲液润湿 , 避免气泡缓冲液润湿使用前 100%甲醇润湿检测方式常规染色，可用放射性和非放射性检测不能用阴离子染料常规染色， 比较于 NC膜， 可用考马斯亮蓝染色，可 用于 ECL 检测，快速免疫 检测。适用范围0.45um

9、一般蛋白0.2um 一分子量小于 20kD 蛋白0.1um 一分子量小于 7kD 蛋 白低浓度小分子蛋 白、酸性蛋白、糖 蛋白和 蛋白 多糖 （ 主要用在核酸检 测中）糖蛋白检测和蛋白质测序价格价格较便宜便宜较贵硝酸纤维素膜 硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且 适用于各种显色方法，包括同位素， 化学发光（ Luminol 类）、 常规显色、 染色和荧光显色； 背景低，信噪比高。 NC膜的使用也很简便，比如不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸 润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了；比如NC膜很容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。转移到 NC膜

10、上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间， Schleicher & Schull公司的一个实验表明，转移到 NC膜上的几种蛋白 4 度条件下保存 5年依然保持免疫识别特性，依然可以得到清晰可信的Western Blot 结果。不过要注意的是 纯的硝纤膜在比较脆， 又容易卷， 操作要小心， 不适合用于需要多次重复清洗的用途因为经不起多次“折磨”。选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常20KD以上的大分子蛋白用 0.45um 孔径的膜， 小于 20KD的话建议选择 0.2um 的，如果小于 7KD的话最好选择 0.1um 的膜。另外还要注意选择纯的NC膜混有含醋酸纤维（ CM）的 NC膜结

11、合力会有所降低。另外提醒一句：由于 NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时 最好使用较温和的 Tween20，而且浓度不要超过 0.3%（据说 0.05%效果最好）。硝纤膜最为大家熟悉和认可的品牌就是Schleicher & Schull； Millipore ； PALL，另外罗氏、 Invitrogen 、GE（ Amersham）、 Santa Cruz 等公司都有提供各式的硝纤膜（估 计 OEM的可能性比较大，不过有时挺奇怪的，OEM的有时比生产厂家卖的还便宜）。Schleicher & Schull 的名字拗口那大概需要舌头在口腔里经过若干次不同弧度和不同 速度的上

12、下往返精确运动再配合适当的吐气才能读得准确优雅， 不过作为第一个提供硝纤膜 的厂家依然广为人知，其 NC膜分为纯 NC膜和强化 NC膜两种： Protran nitrocellulose membrane和 Optitran nitrocellulosemembrane。前者 Protran 一直是 Schleicher & Schull自豪的产品，这种“ 100% Pure Nitrocellulose Membranes ”。一般而言，NC膜越纯，其蛋白结合能力就越高，所以要增加WB的灵敏度和分辨率，提高所使用膜的纯度是个可以考虑的选择。如果 NC膜搀杂一些醋化纤维素这在前面已经提到，会影

13、响蛋白质结合。而 Protran 在制作过程中去除了各种杂质，保证了其纯度，从而增加了蛋白结合能力。除了这 一点以外， Protran 还有低背景、多孔径选择（ 0.45, 0.2, 0.1um ）和保存时间长（实验证 明膜上蛋白辨认时间可长达 5年！真是“路遥知马力”的典范） 等优点。 但是 Protran 由于 是纯 NC膜，比较脆，机械耐受力欠佳，需要小心操作，如果担心自己“粗手粗脚”，那么 就可以考虑一下 Optitran 或者 Pall 公司的以耐受力著称的 BioTrace NT Nitrocellulose Transfer Membrane 。Optitran 是在一层超薄聚酯

14、支撑膜的两面均匀铺上100%纯的硝酸纤维素， 结果表面看起来和纯硝纤膜完全一样，保持了NC膜各种优点，只是内部多了一层中性支持物，大大增强这种强化 NC膜的柔韧度和机械耐受力，不容易卷曲，方便操作，特别是重复标记和洗 脱的实验。不过有的使用过的人反应不如纯NC膜结合能力强。 NC 膜除了一般的 Discs 、Rolls和 Sheets 以外，像 Invitrogen 、 Bio-Rad 公司还有一种方便顾客使用的“ sandwich ”三明 治形，十分有趣。说它有趣是因为考虑周到，利于高通量操作，但其实也就是将滤纸和 NC 膜纸套成滤纸 NC膜滤纸的层迭形式，预先切割装订好，方便使用。不过，卷

15、膜肯定是 最实惠的选择， 只不过要自己动手裁剪切记， 必须带手套操作。 不知道为什么在国外硝纤膜会被当作危险品来运输还要加收运费，所以货期蛮长的，所以还是卷膜好，一卷用 n 年如果非要给这个 n 加个期限，那就是 至少可以用到等我毕业之后。PVDF 膜刚开始做 WB的人也许会有这种疑问： 为什么实验室的老师 （或者师兄师姐们） 在教 我们做 WB的时候，如果是用 PVDF膜做，总是小心翼翼的剪，节省着用，甚至一些边边角角 也舍不得丢掉呢？其实， 这不仅是因为 PVDF膜比较贵，还由于 PVDF膜是做 WB的“杀手锏”。聚偏二氟乙烯（ PVDF）膜作为基质的转印膜由 Millipore 公司在

16、1985 年首先推出。 与硝酸纤维素膜相比， PVDF膜在蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性上都更优越的性 能（ Pluskal,et al.,1986） 。市售硝酸纤维素膜的典型结合量是80- 100g/cm2, 而 PVDF膜结合量是 100- 200g/cm2（而结合强度 PVDF比硝纤膜强 6 倍！）。在艾滋病毒（ HIV）血 清学检验中直接比较 PVDF和硝酸纤维素膜， PVDF膜具有更好的截留总 HIV 抗原能力并提高 抗体检测糖基化被膜抗原的性能。但是PVDF膜最大的优点不仅于此：更好的机械强度和化学耐受性使 PVDF膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择；而且单个凝胶的

17、泳道 复本可用于多种目的，如考马斯亮蓝染色后切出条带并进行 N-末端测序、蛋白消化 / 肽分离 / 内部测序和免疫检测 （ Kurien,et al.,2003） 。特别是需要做 N端蛋白测序， 在相当“严酷” 的清洗条件下，当尼龙或者硝纤膜已经降解的情况下 PVDF膜依然保持本色，笑傲江湖。所 以 PVDF也是要做蛋白测序的唯一选择。 此外， 个人经验， 一些强疏水蛋白用 PVDF膜效果会 更好一些。 PVDF膜适用的检测方法也不少，化学发光、常规显色、同位素和标准染色都一 样 OK，但不适合荧光。 PVDF膜特别注意的是需要 100%甲醇预处理（不超过 15 秒）再用缓 冲液平衡， 才能用

18、， 而且适用过程中万一干了也要同样程序再处理 （不过要真出现这种问题 也是自己欠扁， 谁要你不小心呢， 转膜前处理也就罢了， 转膜后再这样处理可能会影响后继 的抗体识别呢）。 PVDF膜同样分 0.45um 和 0.2um 的，后者孔径小，对小分子蛋白有较好的 拦截吸附，背景可能会比前者稍高。PVDF膜常见的有以下几个品牌公司产品名孔径适用范围参考价格MilliporeImmobilonTransfer0.45um$212Membranes0.2umBio-RadImmun-BlotPVDFChemiluminescent,Membranecolorimetricwesternblots,am

19、ino-terminalsequenceand totalaminoacidcompositionPiercePVDF Membrane0.45umWestern,Southern,0.2umNorthern,and dotblotsPall LifeBioTrace PVDF Transfer0.45umNucleicacid and$149ScienceMembraneproteintransfers.Protein sequencingInvitrogenPVDF Membrane0.45umProteinsequencing,￥1625.80.2umimmunoblottingWhat

20、manWestran ClearSignal0.45umWestern blotsPVDF Membrane作为 PVDF膜的鼻祖， Millipore 公司的 PVDF膜 Immobilon 系列分为 Immobilon-P （ 0.45um ）, -PSQ（0.2um）, -FL（ 用于荧光显色 ） 和 Blotting Sandwiches for High Troughput 四种。 Immobilon-P 膜孔径均一，具有极强的吸附能力，染色性能好、抗溶剂能力强和信噪 比高， 有助于提高检测灵敏度， 而且开放的孔结构容易接近被吸附的蛋白质， 并有助于去除 背景上没有吸附的探针，可以说

21、是免疫印迹检测理想的印迹膜。 Immobilon-PSQ 转印膜是印 迹小分子蛋白质（ 20KDa）的理想选择优良的蛋白质吸附性能，渗漏少。内表面面积较 大，可供蛋白质吸附从而提高蛋白质测序的得率。由于不含污染性支撑物或表面活性剂， Immobilon-PSQ 层析谱上的背景峰值极小。 Immobilon-FL 也是 Millipore 值得骄傲的产品， 因为这是第一个专门为荧光显色优化的转移膜。 通过实验证明， 这种膜在 Kodak 成像系统可 以显示仅 7ng 的蛋白，听起来不错吧，有兴趣可以试一试。这几种膜除了一般的PVDF膜的优点之外，最大特点就是一个字快。按照 Millipore 的

22、操作手册， Immobilon 可以在保证质量的前提下缩短 WB时间到 2 个小时主要是缩短封闭和洗脱时间。这可真是个好消 息，因为坐在那儿等 WB结果多浪费时间啊！缩短这个费时而枯燥的过程，早出结果，可以 提高实验效率，利于我们分析实验结果，考虑下步对策嘛。卷膜经济实惠，裁剪剩下的边角 料还可以用来做点杂交， 而预裁剪的即用膜更适合高通量等等“用金钱换时间”的实验。 再 次强调的是，疏水 PVDF膜在用前必须经过 50%或以上体积比的甲醇或者乙醇溶液处理几分 钟，待膜变成半透明后用 MilliQ 水或者纯水漂洗一下，转入电泳缓冲液平衡才能用。Invitrogen 公司的 PVDF膜也有大家风

23、范：膜是与两张预裁的滤纸同时提供，方便 使用；虽然一般而言 0.2um 的膜渗漏少适用性会更强，但 Invitrogen 的 0.45umPVDF 膜自 有自家优势特别适合于低背景， 高敏感度的印迹反应， 同样需要在乙醇或者甲醇， 或者 异丙醇中浸泡 5 分钟就可以用了。尼龙膜尼龙膜更多是用于核酸的转移，也有见于蛋白印迹，比如 dot blot ，比较于 NC膜 来说，它的优点是结合力强，特结实又柔软且不易卷曲，机械强度大，便于操作，缺点是背 景高由于尼龙膜电荷密度高，使得非结合区的封闭比疏水性NC膜困难，对于灵敏度高的检测方法，背景问题尤为突出（据分子克隆 III 说通过热处理的酪蛋白和 1

24、%聚乙烯吡咯 烷酮延长封闭时间可以改善） ，而且当转移缓冲液中存在有 SDS时蛋白质就容易从尼龙膜上 泄漏（通过甲醛固定可以缓解这一情况）。另外至今也没有适合尼龙膜上的直接染色方法。 因此在许多情况下实验室人员进行WB实验不选择尼龙膜。尽管如此，一些产品却能“取其精华，去其糟粕”，将尼龙膜一些不利于蛋白印迹 的因素缩小或者去除， 使其成为有效的蛋白转移介质。 比如说， 化学发光底物做得相当出色 的 Pierce 公司，其旗下的 Biodyne A&B Nylon Transfer Membrane 就是这样一个产品。这 种分为 A， B 两型的尼龙膜做工精良，孔径大小一致，为了保有尼龙膜高灵敏

25、度的优点和摒 弃背景影响大的缺点， Biodyne 采用了合适的 signal-to-noise 比例来调整，从而达到了 200ug/cm2 的蛋白结合能力，同时有比大多数尼龙膜甚至比一些NC膜都要小的低背景。除此之外， B 型的 Biodyne 对于一些带负电蛋白是一种理想的转移膜，因为它在A 型的基础上提高了正电荷集团的浓度。另外 Biodyne 相对于 NC膜来说还是一种“打不怕，撕不烂，烧 不着（ 200一下）”的“顽强”的转移膜。SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（ SDS PAGE）A：实际操作1. 做胶前的准备1）检查是否有足够的、干净的 spacer 、 comb 和架子。2）检查是否

26、有新鲜的，足量 10%APS，没有立刻重配。3）按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小， 计算出胶的浓度， 并算出分离胶各组分的 用量。2. 制胶，电泳1）装好架子。2）按照下面配方配制分离胶。 （单位： ml，Total ： 8ml）7.5 10 15%2 Sep. buffer44430 Gel.sol2.02.74ddH 2O1.91.20TEMED8ul8ul8ul10%APS80ul80ul80ul在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。3）待分离胶凝集后，配制浓缩胶。 （单位： ml，Total ： 3.5ml）3 2 Stacking. buffer1.730 Gel.so

27、l0.35ddH 2O1.4TEMED5ul10%APS50ul倒好后插入预先准备好的梳子。4）待胶凝集好后，上样，电泳。 上层胶用 60-80V 电压，当样品至分离胶时，用 100-120V 电压。一般电泳时间在 1.5 小时左右。B ：注意事项及常遇到的问题1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。2）上样蛋白量不应超过 30ug/mm2 （ 载荷面即：如果你的胶槽是 5mm 1mm，则载荷面为：21mm 5mm=5mm） 。）gel 通常在 0.5-1h 内凝集最好， 过快表示 TEMED、APS 用量过多， 此时胶太硬易龟裂， 而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两

28、种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特别是甘油。）电泳中常出现的一些现象： 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。 条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或 者两边聚合不完全。拖尾：样品溶解不好。纹理（纵向条纹） ：样品中含有不溶性颗粒。条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。 条带两边扩散：加样量过多。三、转移 在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。 膜的选择： 印迹中常用的固相材料有 NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、 PVDF等。我们选用 PVDF（聚偏二氟乙烯） ，

29、其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。有两 种规格： Immobilon-P （ 0.45um）和 Immobilon-PSQ（0.2um for MW20kDa） 。 A 半干法即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电 流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移 时间短，效率高。实验条件的选择电流 1mA-2mA/cm2，我们通常 100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、 胶浓度选择转移时间， 具体可以根据实际适当调整。目的蛋白分子大小 （kDa）胶浓度转移时间 （h）801408%1.5-2.0258

30、0101.515-40120.75=膜 =胶。2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须 随时保持湿润（干膜法除外） 。4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下 滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。5）转移时间一般为 1.5 小时， （ 1mA-2mA/cm2，10% gel） ，可根据分子量大小调整转移时间 和电流大小。B 湿法 我们基本上不用此方法，这里暂不做介绍。C 转移后效果的鉴定1染胶用考马斯亮兰染色经 destain 脱色后，看胶上是否还

31、有蛋白来反映转移的效果。2染膜 有两类染液选择，可逆的和不可逆的。可逆的有 ponceau-s red 、 Fastgreen FC、 CPTS 等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析用。但是不可逆的染料， 如考马斯亮兰、 india ink 、 Amido.black 10B 等，染色后膜就不能用于进一步的分析。四、封闭（ block ）封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。常用的封闭液有 bovine serum albumin（BSA） ，non-fat milk ，casein ，gelatin ，tween-20 等，我们一般用 non-fat milk 。在转移结束前配好 5%的 Milk（TBST 溶解） 。转移结束后将膜放入 milk 中 block（ 一定要 放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜 ） ，并清洗整理好用过的滤纸，以便下次使 用。 Block 4 C O/N，或 RT 1 小时。五、孵育一抗先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。