生物化学仪器分析-紫外

1、第3章 紫外光谱Ultraviolet Spectrometry, UV主讲：孙立权2022/8/3112022/8/3123.1 紫外吸收光谱分析基本原理Principles of UV3.1.1紫外吸收光谱的产生3.1.2有机物紫外吸收光谱3.1.3有机物紫外吸收光谱3.1.4蛋白紫外吸收光谱3.1.5核酸紫外吸收光谱3.1.6紫外吸收光谱影响因素3.1.7 显色反应2022/8/3133.1 紫外吸收光谱分析基本原理Principles of UV3.1.1 紫外吸收光谱的产生Formation of UV1.概述基于物质对紫外光选择性吸收的分析方法。 250 300 350 400nm

2、1234e2022/8/3142.物质对光的选择性吸收及吸收曲线M + 热M + 荧光或磷光E = E2 - E1 = h量子化 ；选择性吸收定性依据。M + h M *基态 激发态E1 （E） E22022/8/315可见紫外波长范围：100-800 nm.(1) 远紫外光区: 100-200nm (2) 近紫外光区: 200-400nm(3)可见光区:400-800nm3.1.1 紫外吸收光谱的产生Formation of UV2022/8/316可见光谱与紫外光谱的共同之处光谱法：可用于结构鉴定、定性和定量分析；定性依据：特征吸收；定量依据：朗伯比耳定律；能级跃迁：分子中价电子能级跃迁；

3、光谱形状：电子跃迁的同时，伴随着振动、转动能级的跃迁带状光谱。3.1.1 紫外吸收光谱的产生Formation of UV2022/8/317可见光谱与紫外光谱的共同之处吸收曲线（A-曲线）吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。关于吸收曲线的讨论与可见光谱相同3.1.1 紫外吸收光谱的产生Formation of UV2022/8/3183.电子跃迁与分子吸收光谱物质分子内部三种运动形式：（1）电子相对于原子核的运动；（2）原子核在其平衡位置附近的相对振动；（3）分子本身绕其重心的转动。3.1.1 紫外吸收光谱的产生Formation of UV2022/8/319分子具有三种不同能级

4、：电子能级、振动能级和转动能级三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量。分子的内能：电子能量Ee 、振动能量Ev 、转动能量Er即e+v+revr 3.电子跃迁与分子吸收光谱2022/8/3110能级跃迁电子能级间跃迁的同时，总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。3.电子跃迁与分子吸收光谱2022/8/3111讨 论转动能级间的能量差r：0.0050.050eV，跃迁产生吸收光谱位于远红外区。远红外光谱或分子转动光谱；振动能级的能量差v约为：0.05eV，跃迁产生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或分子振动光谱；电子能级的能量差e

5、较大120eV。电子跃迁产生的吸收光谱在紫外可见光区，紫外可见光谱或分子的电子光谱。 2022/8/3112讨 论吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性的依据。吸收谱带的强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有关，也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩尔吸光系数max也作为定性的依据。不同物质的max有时可能相同，但max不一定相同；吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比，定量分析的依据。2022/8/31131有机化合物电子类型及电子跃迁类型三种价电子：电子、电子、n/p电子；电子跃迁类型：n； n； 。sp *s *RKE

6、,BnpECOHnpsH3.1.2 有机物紫外吸收光谱Ultraviolet spectrometry of organic compounds2022/8/3114分子轨道理论：成键轨道反键轨道。当外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态(反键轨道)跃迁。主要有四种跃迁，所需能量大小顺序为：n n 3.1.2 有机物紫外吸收光谱Ultraviolet spectrometry of organic compounds2022/8/31152跃迁所需能量最大；电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁；饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区；吸收波长200 nm；例：甲烷的max为125nm

7、, 乙烷max为135nm。只能被真空紫外分光光度计检测到；作为溶剂使用。2022/8/31163n 跃迁所需能量较大。吸收波长为150250nm，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察到。末端吸收。含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂原子)均呈现n跃迁。2022/8/31174 跃迁所需能量较小，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区，max一般在104Lmol1cm1以上，属于强吸收。 （1） 不饱和烃*跃迁乙烯*跃迁的max为165nm,max为: 1104 Lmol-1cm-1。 K带共轭非封闭体系的*跃迁 C=C 发色基团， 但 *200nm。max=165nm 助色基团

8、取代 * (K带)发生红移2022/8/3118165nm 217nm (HOMO LVMO) max （2）共轭烯烃中的 *5 n跃迁含杂原子的双键化合物，或者当有杂原子上的孤对电子与碳原子上的*轨道，则可产生n *跃迁吸收。200400nm。禁阻跃迁，吸收强度很弱，200nm的光)，但当它们与生色团相连时，就会发生n共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。 (auxochrome)2022/8/31237. 红移与蓝移红移:max向长波方向移动。蓝移 (或紫移):max向短波方向移动。增色效应或减色效应:吸收强度即摩尔吸光系数增大或减

9、小的现象分别称为。有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长max和吸收强度发生变化。2022/8/31249. 有机化合物的吸收带吸收带(absorption band): 在紫外光谱中，吸收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型。 R吸收带 K吸收带 B吸收带 E吸收带吸收带及吸收带类型吸收峰对应的波长位置称为吸收带。R吸收带：由于发生n跃迁而产生的吸收带。n为禁阻跃迁，跃迁几率很小；一般地，R吸收带的270nm，100；当使用极性溶剂时， R吸收带发生蓝移。2022/8/3126吸收带及吸收带类型K吸收带：由*跃迁而产生的吸收带。发生在共

10、轭烯炔分子；吸收很强，104；波长位置小于R 吸收带。1：乙醚2：水12250300苯酰丙酮 非极性 极性n *跃迁：兰移； ； *跃迁：红移； ；2022/8/3127吸收带及吸收带类型B吸收带：位于278nm的吸收带。由苯环的*跃迁引起；吸收较强， =1100 ；在非极性溶剂中测定时有精细结构，而在极性溶剂中精细结构消失。当芳环与发色团直接相连时会同时出现K、B 两带(B 带波长较长)，且B 带产生红移。若分子中含有n 电子，还会有R 带同时出现。2022/8/3128吸收带及吸收带类型E吸收带：在一定意义上，苯环可看成三个共轭的乙烯组成。苯环中的这种乙烯键和共轭乙烯键引起的紫外吸收带分别

11、称为E1 和E2 带。四种吸收带按能量高低排列：一般有E1E2KBR2022/8/312910. 吸收波长的计算非共轭体系：饱和烷烃；有助色团取代的衍生物；孤立发色团。共轭体系：共轭烯烃。2022/8/3130165nm 217nm (HOMO LVMO) max 基-是由非环或六环共轭二烯母体决定的基准值；无环、非稠环二烯母体： max=217 nm共轭烯烃（不多于四个双键） *跃迁吸收峰位置可由伍德沃德菲泽 规则估算。 max= 基+nii a.共轭烯烃中的 *异环（稠环）二烯母体： max=217 nm同环（非稠环或稠环）二烯母体： max=253 nmniI : 由双键上取代基种类和个

12、数决定的校正项 (1)每增加一个共轭双键 +30 (2)环外双键 +5 (3)双键上取代基：酰基（-OCOR） 0 卤素（-Cl，-Br） +5烷基（-R） +5 烷氧基（-OR） +6 2172272022/8/31332022/8/3134b.羰基化合物共轭烯烃中的 * Y=H,R n * 180-190nm * 150-160nm n * 275-295nmY= -NH2,-OH,-OR 等助色基团K 带红移，R 带兰移；R带max =205nm ；10-100K K R R n n 165nm n 不饱和醛酮K带红移：165250nmR 带红移：290310nm 2022/8/3135

13、c. , -不饱和羧酸及其酯 *跃迁K 带红移程度小于 ,-不饱和酮, max约200240nm，104。 由于存在这种共轭，羰基的亲电子性降低，即接受C=C上电子，形成 *跃迁的能力降低，使 ,-不饱和酸及酯发生 *跃迁需要较大的能量， max蓝移。2022/8/3136d. 芳香烃及其杂环化合物 苯：E1带180184nm； =47000E2带200204 nm =7000 苯环上三个共轭双键的 *跃迁特征吸收带；B带230-270 nm =200 *与苯环振动引起；含取代基时， B带简化，红移。max（nm） max苯254200甲苯261300间二甲苯2633001，3，5-三甲苯26

14、6305六甲苯2723002022/8/3137乙酰苯紫外光谱图羰基双键与苯环共轭：K带强；苯的E2带与K带合并，红移；取代基使B带简化；氧上的孤对电子：R带，跃迁禁阻，弱；CCH3On * ; R带 * ; K带2022/8/3138苯环上助色基团对吸收带的影响2022/8/3139苯环上发色基团对吸收带的影响2022/8/3140. 立体结构和互变结构的影响顺反异构：顺式：max=280nm； max=10500反式：max=295.5 nm；max=29000互变异构： 酮 式：max=204 nm 烯醇式：max=243 nm 立体结构和互变结构的影响2022/8/3142. 溶剂的影

15、响1：乙醚2：水12250300苯酰丙酮 非极性 极性n *跃迁：兰移； ； *跃迁：红移； ；极性溶剂使精细结构消失. 溶剂的影响非极性 极性 n n p npn *跃迁：兰移； ； *跃迁：红移； ；max(正己烷)max(氯仿)max(甲醇)max(水)230238237243n3293153093053.1.3 无机化合物紫外可见吸收光谱1. 电荷迁移跃迁 (1)配合物的电荷迁移跃迁 配合物分子吸收光辐射后，分子中的电子由配体的轨道跃迁到与中心离子相关的轨道上，或按相反方向转移，产生电荷迁移跃迁吸收光谱。这种电荷迁移光谱通常发生在具有d电子的过渡金属离子和有丌键的共轭体系的有机配位化合

16、物及许多水合无机离子中。这种配合物电荷迁移跃迁可表达为： 无机配位化合物紫外-可见吸收光谱的电子跃迁形式主要有电荷迁移跃迁和配位场跃迁 两种形式。Mn+Lb-M(n-1) +L(b-1) -h2022/8/3145(2)过渡金属离子与生色团试剂生成配合物的电荷迁移跃迁如Fe()与CNS离子配位。Fe3+CNS-2+hFe2+CNS2+电子给予体电子接受体分子内氧化还原反应； 104Fe2+与邻菲罗啉配合物的紫外吸收光谱属于此。2022/8/31 电荷迁移吸收光谱的波长取决于电子给予体和电子接受体相应轨道的能量差。如金属离子的氧化性强，而配位体L的还原性强，则发生电荷迁移所需的能量较小，则吸收光

17、波长会发生红移 电荷迁移跃迁吸收光谱的谱带较宽，并易受环境因素的影响，用其波谱定性及结构分析比较困难。但电荷迁移吸收光谱最大的特点是摩尔吸收系数很大，一般在104107。因此，用这类吸收谱带进行定量分析时，可以显著提高检测的灵敏度。相反，则吸收光波长会发生紫移。 2. 配位场跃迁（1）配体微扰的金属离子d-d电子跃迁和 f - f 电子跃迁 在配体的作用下过渡金属离子的d轨道和镧系、锕系的f轨道裂分，吸收辐射后，产生d一d、 f 一f 跃迁； 必须在配体的配位场作用下才可能产生也称配位场跃迁； （2）金属离子微扰的配位体内电子跃迁 金属离子的微扰，将引起配位体吸收波长和强度的变化。变化与成键性

18、质有关，若共价键和配位键结合，则变化非常明显。 摩尔吸收系数很小，对定量分析意义不大，但可用于研究配合物的结构，为现代无机配合物键合理论的建立、金属酶和生物无机化学等提供非常有用的信息。2022/8/313.1.4 蛋白质紫外吸收光谱蛋白质具有很强的紫外吸收，通常情况下一般蛋白质在紫外区的最大峰在280nm左右(见图28)。2022/8/31493.1.4 蛋白质紫外吸收光谱利用蛋白质的这一特性，能够设计多种蛋白质定量分析的方法。同时，蛋白质的最大吸收峰不同于核酸的260nm最大吸收峰。基于这种差异，仍然能够利用紫外吸收对含有DNA的蛋白质样品进行定量分析。在小于240nm波长的紫外区有很强的

19、光吸收效应，但较难利用这一特性。这是因为，在这一紫外区，很多缓冲液具有很强的紫外吸收，并且缓冲液一般浓度很高，这会严重干扰蛋白质的定量分析。但如果背景缓冲液不具有紫外吸收的特性，则可以充分利用蛋白质在200220nm的强紫外吸收性质。2022/8/31503.1.4 蛋白质紫外吸收光谱蛋白质的紫外吸收特性主要是由蛋白质所含的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等引起。由于苯环(包括共轭双键等)的存在，这几种氨基酸在240300nm的紫外区内均具有强力的光吸收特性；虽然其他氨基酸也具有紫外吸收的性质，但在此紫外区内一般很弱，对蛋白质的紫外吸收贡献不大。2022/8/31513.1.4 蛋白质紫外吸收光谱蛋白

20、质的紫外吸收受多种因素的影响。由于蛋白质分子为高分子聚合物，其构象受多种 因素(如溶液的pH、离子强度、金属离子、温度和变性剂等)的影响；而蛋白质构象的变 化会改变具有紫外吸收的氨基酸在蛋白质表面的分布，进而影响蛋白质的紫外吸收光谱。特别值得注意的是，如蛋白质富含紫外吸收的氨基酸，其吸收系数会增加；相反，则降低。这 在蛋白质的定量分析时需要注意。2022/8/31523.1.5 核酸紫外吸收光谱核苷、核苷酸、核酸的成分都有嘌呤和嘧啶碱基，这些碱基全含有共轭双键，使得这些碱基能强烈吸收240290nm波段的紫外线，最大吸收在260nm左右。因此核酸、核苷酸和核苷具有紫外吸收特性，DNA钠盐在23

21、0nm处为吸收低谷，但它的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值，其吸光度(absorbance)以A260表示，A260是核酸的重要性质，在核酸的研究中很有用处。RNA钠盐的吸收曲线与DNA的无明显区别。不同核苷酸有不同的吸收特性，所以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。2022/8/31533.1.5 核酸紫外吸收光谱双链DNA和单链DNA的紫外光谱相似，摩尔吸收系数有大差。原因：双链中碱基被包裹在双链内部，弱；单链外露，强。2022/8/3154 温度对DNA的紫外吸收有明显的影响。在温度为70C以下，DNA以双链形式存在，因此紫外吸收相对较低。在7085C时，温度对DNA的紫外吸收具有显

22、著的影响。85C以后，温度的增加对DNA紫外吸收的影响很弱，这是由于在85C以上，DNA以单链形式存在，紫外吸收接近最大值。变性温度(melting temperature，Tm)是指双链DNA分离成两个单链DNA时对应的温度。这一特性对DNA的分离分析非常重要。如PCR的设计就是基于DNA的变性温度的基础。3.1.6 影响UVVis分析的因素：【1】温度 【3】溶液的浓度【2】pH的影响【4】光源狭缝的宽度【5】背景的吸收 1】条件 化学反应，也就是显色反应对多种物质进行测定，常利用显色反应将被测组分转变为在一定波长范围有吸收的物质。常见的显色反应有配位反应、氧化还原反应等。3.1.7 显色

23、反应（条件和影响因素）这些显色反应，必须满足以下条件： 【4】.反应生成物的组成恒定。【3】. 反应生成的产物有足够的稳定性，以保证测量过程中溶液的吸光度不变；【2】反应有较高的选择性，即被测组分生成的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光谱有明显的差别；【1】反应的生成物必须在紫外-可见光区有较强的吸光能力，即摩尔吸光系数较大；影响显色反应的因素：【1】酸度 显色反应最适宜的酸度范围可通过实验来确定：测定某一固定浓度的试样的吸光度随酸度的变化，以吸光度为纵坐标，溶液的PH值为横坐标作图。【3】.显色时间和温度【2】.显色剂的用量 测定试样溶液的吸光度，需先用参比溶液调节透光度（吸光度为0）为10

24、0%，以消除其它成分及吸光池和溶剂等对光的反射和吸收带来的测定误差。（3）、参比溶液的选择参比溶液的选择视分析体系而定，具体有： 1】溶剂参比 试样简单、共存其它成分对测定波长吸收弱，只考虑消除溶剂与吸收池等因素； 2】试样参比 如果试样基体溶液在测定波长有吸收，而显色剂不与试样基体显色时，可按与显色反应相同的条件处理试样，只是不加入显色剂。3】试剂参比 如果显色剂或其它试剂在测定波长有吸收，按显色反应相同的条件，不加入试样，同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。 4】. 平行操作参比 用不含被测组分的试样，在相同的条件下与被测试样同时进行处理，由此得到平行操作参比溶液。3.2 紫外分光光度计Ult

25、raviolet spectrometer一、基本组成general process二、分光光度计的类型types of spectrometer2022/8/3163一、基本组成光源单色器样品室检测器显示1. 光源 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。 可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在3202500 nm。 紫外区：氢、氘灯。发射185400 nm的连续光谱。2022/8/31642、单色器将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出任一波长单色光的光学系统。棱镜材料石英2022/8/31653、样品室样品室放置各种类型的吸收池

26、（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。2022/8/31664、检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号常用的有光电池、光电管或光电倍增管。2022/8/31675、结果显示记录系统检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理。2022/8/3168二、紫外分光光度计的类型1.单光束：简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。2.双光束：自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高

27、。2022/8/3169二、分光光度计的类型3.双波长：将不同波长的两束单色光(1、2) 快速交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。=12nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。2022/8/3170光路图2022/8/31713.3 紫外吸收光谱的应用Applications of UV一、定性和定量分析qualitative and quantitative analysis二、有机物结构确定structure determination of organic compounds2022/8/3172一、定性、定量分析1. 定性分析 max：化合物特性参数，可作为定性依

28、据； 有机化合物紫外吸收光谱：反映结构中生色团和助色团的特性，不完全反映分子特性； 计算吸收峰波长，确定共轭体系等 甲苯与乙苯：谱图基本相同； 结构确定的辅助工具； max ， max都相同，可能是一个化合物； 标准谱图库：46000种化合物紫外光谱的标准谱图 The sadtler standard spectra ,Ultraviolet 2022/8/317331 八月 2022742. 纯度鉴定依据： max ； 峰形状和数量；A。生物大分子紫外吸收特征。核酸分子中含有碱基， max = 260nm核酸典型吸收：260nm；纯核酸A280/ A260=0.5。蛋白质分子中含有芳香族氨基

29、酸， max = 280nm蛋白质典型吸收：280nm；纯蛋白A280/ A260 1.8。3. 定量分析依据：朗伯-比耳定律吸光度： A= b c；透光度：-lgT = b c。灵敏度高：max：104105 L mol-1 cm -1；测量误差与吸光度读数有关： A=0.434，读数相对误差最小；2022/8/3175代入朗伯-比尔定律有： c/c=0.4343T/TlgT要使测定的相对误差c/c最小，求导取极小得出： lgT=-0.4343=A即当A=0.4343时，吸光度测量误差最小。 最适宜的测量范围为0.20.8之间。测定方法【1】 单组分定量方法 单组分是指样品溶液中含有一种组分

30、，或者是在混合物溶液中待测组分的吸收峰与其他共有物质的吸收峰无重叠。其定量方法包括校准曲线法、标准对比法和吸收系数法。1 校准曲线法方法：配制一系列不同含量的标准溶液，选用适宜的参比，在相同的条件下，测定系列标准溶液的吸光度，作A-c曲线，即标准曲线，也可用最小二乘数处理，得线性回归方程。 在相同条件下测定未知试样的吸光度，从标准曲线上就可以找到与之对应的未知试样的浓度。【2】 标准对比法 即将待测溶液与某一标样溶液，在相同的条件下，测定各自的吸光度，建立朗伯-比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量。 As=Kcs Ax=Kcx【3】 F因子法 二、有机化合物结构辅助解析1. 由紫外谱图可获得的

31、结构信息（1）200-400nm 无吸收峰。饱和化合物，单烯，非共轭烯。（2） 270-350 nm有吸收峰（=10-100）醛酮 n* 跃迁产生的R 带。（3） 250-300 nm 有中等强度的吸收峰（=200-2000），芳环的特征 吸收（具有精细解构的B带）。（4） 200-250 nm有强吸收峰（104），表明含有一个共轭体系（K）带。共轭二烯：K带（230 nm）；不饱和醛酮：K带230 nm ，R带310-330 nm260nm,300 nm,330 nm有强吸收峰，3,4,5个双键的共轭体系。 2022/8/31802.光谱解析注意事项(1) 确认max，并算出，初步估计属于何种吸收带；(2) 观察主要吸收带的范围，判断属于何种共轭体系；(3) 乙酰化位移B带： 262 nm(302) 274 nm(2040) 261 nm(300)(4) pH值的影响 加NaOH红移酚类化合物，烯醇。 加HCl兰移苯胺类化合物。2022/8/31813. 分子不饱和度的计算定义：不饱和度是指分子结构中达到饱和所缺一价元素的“对”数。如：乙烯变成饱和烷烃需两个氢原子，不饱和度为1。计算： 若分子中仅含一，二，