分子生物学检验：基因组结构与特征-人类基因组

1、第三节 基因组结构与特征（三） 人类基因组人体细胞的核型 细胞是人体生命活动的基本单位（40万个） 每个细胞都带有人体整套的遗传基因。 2.5万个基因，排列在23对染色体上。人类基因组的特征人类核基因组概貌 基因组大小：约30亿个碱基对； 基因的平均长度：27kb； 外显子的平均长度：145bp； 编码蛋白质的结构基因：约22.5万个，占总长度的1.5； 非编码区比例：9597。 人类核基因组的构成一.单一序列（unique sequence） 单一序列在人类基因组中只出现一次或数次，大多数编码蛋白质或者酶的结构基因属于单一序列。单一序列的基因结构二.重复序列串联重复序列（tandem rep

2、eats） 又称高度重复序列，在人类基因组中占1015%，有3种类型：1、卫星DNA（satellite DNA） 是多种短重复序列的混合物，重复序列长度在5100 bp；存在于异染色体以及中心粒和端粒附近，通常不转录。 小鼠卫星DNA的EcoR酶切的电泳扫描图。 除产生了单体重复和多聚体重复单位的整数倍单位外，还产生了0.5倍，1.5倍，2.5倍等非整数倍的重复单位。2、小卫星DNA（mini-satellite DNA） 也称为可变数目的串联重复序列（variable number tandem repeats，VNTRs） 重复序列长度在10100 bp之间；主要分布于常染色体，有高度的

3、多态性。3、微卫星DNA（micro-satellite DNA） 又称为简单序列重复（simple sequence repeats，SSR）或短串联重复（short tandem repeats， STR）。重复序列为16个核苷酸，常见(CA)n、(TG)n、(CT)n，重复次数多为1560次，总长度一般在400 bp以下。 存在于着丝粒、端粒区及染色体的其他区域，直接参与编码蛋白质和参与遗传物质的结构改变。 散在重复序列（interspersed repeats） 属于中度重复序列，主要由较大的片段（由100到数千bp）串联重复组成，分散在整个基因组中，重复频率:103105，具有种属特

4、异性，可作为DNA标记。分为3种类型：1.长散在核元件（long interspersed nuclear element, LINE）： 长度1000bp，占基因组20%，与RNA聚合酶有关，转录的RNA可编码逆转录酶。 短散在核元件（short interspersed nuclear element, SINE）： 长度500bp，占基因组11%，与RNA聚合酶有关，不编码逆转录酶。 rRNA基因、tRNA基因和Alu序列存在散在重复序列， Alu序列主要为SINE。2.LTR逆转录转座子（LTR- retroposon)又称逆转录病毒样元件（retrovirus-like elemen

5、ts）3. DNA转座子（DNA transposons）真核生物染色体上的各种重复顺序与结构元件多基因家族是由同一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因。多基因家族特征：1.基因数目2个以上； 2.基因功能相似且核苷酸序列具有同源性；3.所编码的同源蛋白（蛋白质家族）具有相似的功能。 多基因家族的某些成员并不产生有功能的基因产物，这些基因被称为假基因。假基因的特征: 1.与具正常功能的基因序列相似 2.无转录功能或转录产物无功能三、多基因家族（multi gene family）和假基因（pseudogene）（一）珠蛋白基因家族（二）组蛋白基因家族Pseudogenes are dead

6、ends of evolution假基因可能是由RNA反转录成cDNA后再整合到基因组中产生四、CpG岛（CpG island） 哺乳动物中，CpG序列在基因组中出现的频率仅有1%，但在基因组的某些区域中，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称为CpG岛。 人类基因组中约有28890个CpG岛，每个CpG岛大约含有12kb，大部分染色体每1 Mb就有515个CpG岛，CpG岛的数目与基因密度有良好的对应关系。 人类基因组中所有管家基因以及约一半的组织特异性表达的基因启动子区域都含有CpG岛。CpG岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区，也有部分的CpG岛位

7、于基因的启动子区域外。CpG岛与甲基化CpG岛过甲基化所致基因去表达，是主要的表观遗传学改变之一。通常只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化。健康人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则通常是甲基化的。这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG位点则呈高度甲基化状态，使抑癌基因去表达。 CpG岛甲基化异常（CpG突变为TpG），可导致肿瘤发生。这是由于癌变细胞中DNA甲基转移酶活性异常，存在于CpG岛的5-甲基胞嘧啶自发脱氨生成胸腺嘧啶，使甲基化CpG变异为TpG

8、，引起染色体结构、DNA及蛋白质因子相互作用方式改变。CpG岛甲基化可作为恶变的生物学指标。肿瘤组织中抑癌基因CpG岛甲基化水平 在MassARRAY时间飞行质谱生物芯片系统检测中，乳腺癌组织和外周血BRCA1基因的CpG岛甲基化水平明显高于正常组织。Ramin Radpour. Plos ONE(2011)人类基因组的多态性（polymorphism） 基因组DNA序列某些碱基位点的变异并不致病，这种在群体中出现频率高于1%的变异称为多态性。多态性位点与某些疾病的易感性有关。限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP) R

9、FLP技术是第一代DNA分子标记技术。在基因组中，不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，当内切酶水解DNA序列时，不同的个体可产生长度不同的DNA片段，称为限制性片段长度多态性，该多态性片段作为遗传标志。 理论上，凡是可以引起酶切位点变异的突变（如点突变、DNA序列的插入和缺失等）均可产生RFLP。 但RFLP多态信息含量低，多态性水平依赖限制性内切酶的种类和数量，其应用受到一定的限制。 小卫星与微卫星多态性1.小卫星多态性 当将人类的总DNA提取后，用限制性内切酶切成不同长度的片段，再以VNTRs中的特异顺序为探针进行Southern杂交，可发现阳性片段的长度各不相同。 由于不同个体

10、的VNTRs的数目和位置的差异，使VNTRs的Southern杂交带谱具有高度的个体特异性，称为DNA指纹（DNA fingerprints）。 两种类型： 1）高变小卫星（hypervariable minisatellites） 主要位于着丝粒区，核心单元：924个bp 2）端粒小卫星（telomeric minisatellites） 位于染色体亚着丝粒区，重复序列：TTAGGG 端粒是真核细胞内染色体末端的蛋白质-DNA结构,其功能是完成染色体末端的复制，使染色体免遭融合、重组和降解。 人的端粒长度大约15kb，结构为染色体末端TTAGGG序列上千次的重复；细胞的每次分裂，端粒逐渐缩短

11、，直至细胞衰老。染色体端粒（telomere）DNA指纹技术在亲权及法医鉴定中的应用 亲本之间长度不同的等位基因与DNA指纹分析相结合，可以确定亲本和后代之间的遗传。来自犯罪现场的血迹指纹*和7个嫌疑者的血液指纹，其中标本3和犯罪现场的血迹指纹相同。2.微卫星多态性 微卫星DNA（STR）多存在于基因组非编码区及内含子中，具高度多态性,是非常重要的一种遗传标记。 STR的类型： 1）单纯STR：单一重复单元组成，如（AT）n 2）复合STR：2个或以上重复单元组成，如（AT）n（GT）m 3）间隔STR：重复序列中含有其他核苷酸，如（AT）n GG （AT）mSTR位点的不稳定性与疾病的相关性

12、: 如果父母本的某个或某些STR重复次数超过正常个体的上限，处于一种前突变状态，易造成后代相应位点核心序列重复数目急剧增加（动态突变）。微卫星多态性脆性X染色体综合症临床特点： 中度重度智力低下 语言障碍 特殊体征：长脸、招风耳、大睾丸。发病机理: 与FMR-1基因的CGG区的重复次数( CGG )n有关 CGG区的重复次数： 正常人： 60次携带者：约60100次患者： 100次单核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)等位基因的多态性，即在一个群体中基因组内某一基因座位上可以有两个或两个以上的等位基因。同样，在基因组内某一特定核苷酸位置上，也

13、可以有不同的核苷酸。SNP指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的核苷酸，其中最少一种在群体中的出现频率大于1%（频率小于1%为点突变）。 SNP与RFLP和STR等DNA标记的主要不同是不再以长度的差异作为检测手段，而直接以序列的变异作为标记。 SNPs在人类基因组中广泛存在，已分类的SNPs有数百万个。在单个基因或整个基因组中的分布不均匀，多存在于非转录序列中。 SNPs在基因组中的分布比RFLP、STRs更为普遍，绝大多数DNA多态性为SNPs，人类基因组中90%的多态性属于SNPs。 SNPs的分类： 1）基因编码区SNPs（coding region SNPs，cSNPS） 2）基因

14、周边SNPs（perigenic SNPs，pSNPs） 3）基因间SNPs（intergenic SNPs，iSNPs）SNP的分布及类型SNPs-遗传多样性的分子基础当比较两个随机个体的7号染色体上的一段DNA序列时，在2200个核苷酸中出现两个单核苷酸多态位点（SNPs）。SNP的特点1.单个碱基的变异（主要是置换，也有缺失和插入）引起的DNA序列多态性。 2.CG序列出现最为频繁，多为C转变为T。 CG中C常甲基化、自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。3.在蛋白质编码区的SNP与蛋白的功能有关，对致病具有重要意义。4.是新一代的遗传标记(第三代遗传标记）。 通过全基因组关联分析发现和定位疾病基

15、因 如：骨质疏松症、糖尿病、心血管疾病、肿瘤等的基因定位及遗传病的单倍型诊断。 指导用药和药物设计 通过研究遗传多态性与个体对药物敏感性或耐受性的相关性，可阐明遗传因素对药物效用的影响。用于进化和种群多样性的研究 构建整个基因组的SNP图谱，对比人群之间SNP图谱的异同。SNP主要用途人类基因组单体型图（Haplotype Map，HapMap）计划 在人类基因组的30亿个单核苷酸中，常见的SNP位点有数百万个。这些差异中的一部分造成了人们罹患疾病风险的不同。 HapMap分为两个阶段，第一阶段是对整个人类基因组的30亿个碱基进行平均5千个碱基（5kb）密度的SNP分型测定，构建“5kb单体型

16、图”。第二阶段是在第一阶段基础上进行更高密度的分型测定和后期数据的分析，以获得更精细的单体型图。 HapMap计划的目标是通过比较不同个体的基因组序列来确定染色体上共有的变异区域，帮助生物医学研究人员发现与疾病或个体对药物反应相关的基因。一旦从HapMap中获得标签SNPs的信息，研究者将能利用它们来定位与重要医学特征相关的基因。可以集中研究可能与疾病相关的特定候选基因，也可以纵观整个基因组来找到与疾病相关联的染色体区域。 中国在整个项目中承担10%的任务，即构建第3号、第21号染色体和第8号染色体短臂的单体型图。 单体型的起源 图示两个祖先染色体经过多代的重组拼接产生不同的子代染色体。 如果

17、祖先染色体上的一个多态位点（用X作为标记）会增加罹患某种疾病的风险，两个遗传了祖先染色体带X标记部分的子代个体也会增加这种风险。 被X标记的位点附近有许多SNPs可以用来定位该变异位点。 HapMap的研究策略 分为三个步骤：（a）在多个个体的DNA样 本中鉴定单核苷酸多态性（SNPs）；（b）将群体中频率大于1%的那些共同遗传的相邻SNPs组合成单体型；（c）在单倍型中找出用于识别这些单体型的标签SNPs。 通过对图中的三个标签SNPs进行基因分型，研究者可以确定每个个体拥有图示的4个单体型中的哪一个。 拷贝数多态性（copy number polymorphisms，CNPs) 在所有人类

18、和其它哺乳动物中，有许多DNA片段大小从200bp2Mb范围内的拷贝数突变，涉及一个或连续的几个基因。这些拷贝数的删除、插入、复制和复合多位点的变异统称拷贝数多态性（copy number polymorphisms，CNPs) 或者拷贝数变异（copy number variations，CNVs) 。 在全基因组测序和基因芯片技术发明前，受限于基因组内高通量DNA拷贝数检测手段，人们对全基因组范围内CNP数量和分布知之甚少。2004年，全球内数个HGP研究基地意外地发现，表型正常的人群中,不同的个体间在某些基因的拷贝数上存在差异,一些人丢失了大量的基因拷贝，而另一些人则拥有额外、延长的基因拷贝，研究人员称这种现象为“基因拷贝数多态性”。 由于CNP才造成了不同个体间在疾病和药效等方面的差异。研究