实验11 氨基酸的薄层层析分离和鉴定

1、实验11氨基酸的薄层层析分离和鉴定一实验目的理解薄层层析原理，掌握薄层层析技术，学会氨基酸的较为精确的定性。二实验原理1层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学 性质的差别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性），使各组分在两个相中的分 布不同，其中一个相是固定不动的（称为固定相），另一个相则流过此固定相（称为流动相）并 使各组分以不同速度移动，从而达到分离。2固定相：可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等）也可以是液体物质（如固定 在硅胶或纤维素上的溶液）3流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超 临界

2、体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。4层析技术利用分离混合物一些结构类似、理化性质也相似的化合物组成的混合物，一般应用化学方法 分离很困难，但应用色谱法分离，有时可得到满意的结果。鉴定化合物在条件完全一致的情况，纯的化合物在薄层色谱或纸色谱中都呈现一定的移 动距离，称比移值（R f值），所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。 但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温 度和展开剂纯度、组成、挥发性等。所以，要获得重现的比移值就比较困难。为此，在测定 某一试样时，最好用已知样品进行对照。薄板

3、层析:通常将吸附剂（载体）铺在光洁的表面上（如玻璃板、金属或塑料等），形成 均匀的薄层。然后以流动相展开，样品中的组分不断地被吸附剂（固定相）吸附，又被流动 相溶解（解吸）而向前移动。由于吸附剂对不同组分有不同的吸附能力，流动相有不同的解 吸能力，因此，在流动相向前流动的过程中，不同组分移动的距离不同，因而得到分离。5薄层层析特点装置简单，操作简便。展开耗时短，一般20 30min即可上行十几厘米。斑点扩散少，检出 灵敏度高。（0.01ug）同一薄层析可用多种试剂显斑。加厚薄层后可用于制备。（50mg） 三实验器材1材料（1）玻板：除另有规定外，用5cmX20cm， 10cmX20cm或20c

4、mX 20cm的规格，要求光滑、平 整，洗净后不附水珠，晾十。（2）固定相或载体：最常用的有硅胶G、硅胶GF、硅胶H、硅胶HF,其次有 硅藻土、硅藻土 G、氧化铝、氧化铝G、微品纤维素、微晶纤维素F等。其颗粒大小,一般要求直径为1040 m。薄层涂布，一般可分无粘合剂和含粘合剂两种;前者系将固定相直接涂布于玻璃板上，后者系在固定相中加入一定量的粘合剂，一 般常用1015%煅石膏（CaSO4.2H2O在140C烘4小时），混匀后加水适量使用，或用羧甲基 纤维素钠水溶液（0.50.7%）适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。也有含一定固定相或缓 冲液的薄层。点样器同纸色谱法项下。展开室应使用适合薄层板

5、大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密的盖子，除另有规定 外，底部应平整光滑，应便于观察。2主要仪器带密封盖的层析缸、毛细管(0.5mm)、100C的烘箱、电吹风机、载玻片(75mm*25mm)、 玻璃棒、药勺、烧杯(100ml)、量筒(10ml)、滤纸、喷雾器、直尺、铅笔。3 .试剂氨基酸标准溶液：甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸10mg / ml水溶液。各25ml样品液：混合氨基酸的水溶液。25ml展开剂：水：乙醇：乙酸=1:6:0.5 500ml显色剂：0.5%茚三酮溶液(茚三酮O.5g溶于乙醇l00ml中。)四、操作方法1、硅胶G薄层板的制备清洗玻璃板：先用洗衣粉和水清洗干净，再经自来水淋

6、洗，经酒精冲洗后放入烘箱烘干， 取用时只能于指接触板的边缘。制备浆液：称取3g硅胶G于烧杯中，缓慢地加入9ml0.5%羧甲基纤维素钠溶液，边加边 搅拌，加料完毕用玻璃棒剧烈搅拌调成均匀浆液。涂片：将调好的浆液倒在玻璃板上，将板倾斜使浆液铺开，再将板拿起用于左右摇晃，使 浆液均匀附在玻璃板上，其厚度为0.251mm，然后用纸轻轻擦去薄板四周多余浆液(取拿 板时只能触及板的顶部及两侧)，把薄板放桌面上晾十。活化：将硅胶板于105110C烘箱内烘30min，取出冷却放在干燥器内保存备用(薄层活 化温度一般不超过128C，以免引起石膏脱水失去固着能力)。2、点样在距离薄板一端约1-1.5cm处用细线向

7、下压硅胶(用铅笔划一线)，压成一条点样线。用直径约1mm或0.55mm的玻璃毛细管分别吸取甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸及混 合氨基酸溶液，在点样线上点样，每隔0.8cm处点一种样品(约5ul)，与薄板垂直方向轻轻 碰点样处点样，直径约23mm。待点样处十后(可用吹风机吹干)，再将样品在原点样处重复 点一次。氨基酸的点样量以5ul为宜，含氨基酸0.5-2ug。3、展开硅胶板的点样端向下，倾斜地放入层析缸内，使其与缸底平面呈约15-30度角。用长颈漏斗加入展开剂使展开剂离点样处1cm处为止。即点样端浸入展开剂深度约0.3cm 一 0.5为宜盖上层析缸盖进行层析。当溶剂前沿距上边缘1厘米处时，取出薄层板，立即用笔标出溶剂前沿的位置，将硅胶 板置干燥箱烘干。4、显色用喷雾器均匀地喷上茚三酮显色剂将玻板置105C干燥箱内烘干，约10分钟左右即可显出粉红色斑点(脯氨酸为黄色)。五、结果与计算用大头针轻轻划出所有斑点的轮廓，再用尺量出每个斑点从原点至斑点中心的距离及原点全 展开剂前沿距离，计算出Rf值。氨基酸移动