分离科学第一章沉淀法

1、分离科学第一章沉淀法第1页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一1分离科学意义 生产实践中成本构成，工艺过程可能就是分离过程。 环保尤其是水资源利用 基础医学和临床医学 生物分离的重大前沿意义：多种新的分离技术和分离方法。本课程授课倾向：与生产实践相关，次新的分离技术的方法原理和应用。主要分离对象是生物样品和天然产物。第2页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一2沉淀法溶剂萃取法树脂法膜分离技术凝胶萃取法双水相萃取法超临界流体萃取法泡沫分离法中草药有效成分分离示例吕家根化学楼1465,1410第3页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一3第一章

2、沉 淀 法为什么会溶解？ 沉淀法是化学工程中最常用和最简单的提取方法，它是利用加入试剂或改变条件使产物或干扰物离开溶液，生成不溶性颗粒而沉降析出。沉淀和结晶在本质上同属一种过程，都是新相析出的过程，主要是物理变化，当然也存在有化学反应的沉淀或结晶。沉淀和结晶的区别在于形态的不同，同类分子或离子以有规则排列形式而析出称结晶，同类分子或离子以无规则的紊乱排列形式而析出称为沉淀。 第4页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一4 沉淀法的优点为设备简单、成本低、原材料易得，便于小批量生产，在产物浓度愈高的溶液中沉淀越有利、收率越高；缺点为过滤困难、产品质量较低需重新精制。 本章介绍在化

3、学工程中使用的沉淀法主要包括盐析法，有机溶剂沉淀法，等电点法以及其它沉淀法。第5页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一5等电点法 由于试剂费用低廉，是一些普通的酸或碱，以改变pH值使分部沉淀成为一种工业方法，同样是富有吸引力的。 等电点法主要用于一些两性电解质的产物中，例如抗菌素(四环素)、氨基酸(谷氨酸)以及水化程度不大或憎水性的蛋白质例如酪蛋白等，下面我们以谷氨酸为例来讨论等电点法的具体应用。第6页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一6 谷氨酸的等电点 谷氨酸分子中合有两个酸性的羧基和一个碱性的氨基，是一种两性电解质，它在不同pH的溶液中可以至阳离子、两

4、性离子和阴离子等四种不同的离子状态而存在，分别以GA、GA、GA-、GA2-表示。存在有如下平衡关系。 由实验测得三个极性基团的表观电离常数及pK值： 第7页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一7第8页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一8不同pH时谷氨酸的电离平衡第9页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一9从谷氨酸的各级电离常数，用电子计算机可以方便求得在不同pH值下各种离子的分配情况。计算公式的导出，令浓度单位为mmoL/mL整理后得：若溶液中谷氨酸的总量为1mmo1，即： 第10页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一

5、10合并得： 令：则：第11页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一11设H+浓度为x则A、B、C、D都是x的函数，就可用电子计算机进行演算，其结果描绘成下图。 第12页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一12从计算机得到的数据或上图，就能得到任一pH值下离子的分配情况，例如当pH值3.22时，GA：GA：GA-：GA2-7.861：84.24，7.861：0.278910-5。若pH达到7左右时，随着-羧基的电离，谷氨酸主要以阴离子GA-存在，占溶液离子总数的99.61%，pH值再继续升高，随着-谷氨酸电离，并与溶液中的OH-中和，使谷氨酸以另一种阴离子GA

6、2-存在，在pH值13时，阴离子GA2-占溶液中离子总数的99.95。从上可见，谷氨酸根据溶液pH值的不同，可以成为带正电荷的阳离子，也可以成为带负电荷的阴离子。当介质达到一定的pH值(3.22)时，谷氨酸呈电中性，此时就称为谷氨酸的等电点。 第13页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一13 在等电点时，谷氨酸分子中氨基和羧基相互中和的结果，生成一种内盐形式的分子，它可以看成为羧基电离产生的H+与氨基结合成两性离子(或偶极离子)，因此谷氨酸的等电点也就是呈电中性时溶液的pH值习惯上以pI表示。可利用其总电离平衡常数值求得。 第14页，共76页，2022年，5月20日，11点1

7、分，星期一14因为在等电点时，溶液中总静电荷为零，所以GA-GA+，则上式可简化为 因第15页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一15谷氨酸在等电点时，绝大部分以偶极离子(GA+)状态存在，分子内部正负电荷相等，并且有等量的带不同电荷的阳离子(GA+)和阴离子(GA-)，因此，溶液的总静电荷等于零。谷氨酸分子之间由于相互碰撞并通过静电引力的作用结合成较大的聚合体而沉淀。所以在等电点时表现有最低溶解度性质见表。工业生产中等电点法提取谷氨酸，就是利用这一特性。 第16页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一16A ：谷氨酸结晶L-谷氨酸结晶属于斜方晶系离子晶体，具

8、有多晶型性质，在不同的条件下，可以得到。型谷氨酸结晶和型谷氨酸结晶。由x射线衍射仪测得空间三方向晶轴如下：第17页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一17由表可知-型结晶晶轴长短接近，因此，晶体粗壮，呈颗粒状；而-型结晶，其晶轴长短悬殊，b方向轴特别长，呈针状或鳞片状。 -型结晶是大型结晶，在纯谷氨酸溶液个为斜方六面晶体(观察等电析出的晶体为四面晶体)。纯度高、颗粒大、质量重、易沉降、与母液分离容易，是一种理想的结晶，而-型结晶晶粒细、纯度低、质量轻、难沉降、不易沉淀析出，因此在生产中要控制结晶条件，以析出-型结晶，如出现-型结晶则沉淀物细、结晶不易沉降、分离困难、收率大减。

9、第18页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一18B：影响晶型的条件 1发酵液中谷氨酸浓度对晶型的影响。由下表所列数字表明，在室温自然冷却条件下随着谷氨酸含量的升高，-型谷氨酸结晶增多，水分增多，纯度降低，分离因难。第19页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一19 A：谷氮酸的含量 发酵液中谷氨酸含量在4以上时，等电结晶操作容易，收率可达60左右，谷氨酸含量太低，如1.5-3.5%常温下溶液的过饱和率小，结晶的生成速度慢、收率低，因此，对产酸较低的发酵液为了提高收率，中和时采取多加高流分(离子交换柱洗脱下的高流液，加酸调至1.5用于等电中和)，以增加谷氨酸含量

10、；同时在晶核形成前投入晶种，以促进结晶的形成。此外，也可在去菌体后70下进行真空浓缩，然后再等电点提取，也可采用离子交换柱直接吸附分离，再等电结晶。 第20页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一20由表可知，析出结晶的温度超过30时，-型晶体增加。因此，必须把发酵液温度降到30以下，以避免形成-型晶体。2结晶析出温度对晶型的影响。第21页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一21B：温度的影响 谷氨酸的溶解度随温度的降低而变小，结晶析出温度对晶体型式有很大影响。粒状的型晶体，结晶温度必须降低到30以下，以避免形成型晶体。在等电中和过程中，温度缓慢下降，结晶颗粒

11、粗大。降温过快。结晶颗粒细小，最后温度越低越好，可以使谷氨酸充分析出。低温等电点法，终温控制在3-5，收率可提高到80左右。由于结晶过程是放热反应，温度较难控制，原则上必须避免温度回升，温度的逆转会引起 晶型向晶型的转变，导致收率下降，生产上以控制酸的流加速度来确保温度的缓慢下降。第22页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一22C：加酸速度的影响加酸的目的在于使pH降低到谷氨酸的等电点。加酸速度的快慢对晶体的大小影响较大。缓慢加酸使谷氨酸的溶解度逐渐下降，晶核的形成不会太多大快，育晶后颗粒大易沉降分离，加酸速度过快，容易形成局部过饱和，晶核形成太快太多，结晶颗粒小，不易沉降分

12、离，影响收率。操作上一般采用前期加酸稍快，中期(晶核形成前)加酸要缓，后期加酸要慢的原则，直至pH降低至等电点为止。 谷氨酸的溶解度在等电点偏酸时增加较慢，偏碱时增加较快，pH值以控制在3.0-3.2为最好，如低于3.0提取收率也会降低。第23页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一23工厂生产一般用盐酸中和，如用硫酸易形成型结晶同时对发酵液中的Ca2+要进行预处理，以防止硫酸钙沉淀降低谷氨酸纯度，等电点-离子交换法采用高流分调pH，流加速度一定要慢，防止局部过饱和。 D：晶种 适时投放品种，有利于产品收率的提高。投放晶种的条件要准确，应控制在溶液的介稳区，生产上是根据含量和P

13、H值来决定投种时间，一般谷氨酸含量为5左右时，在pH4.0-4.5投品种；含量为3.5-4.0时，在pH3.5-4.0投放品种，投种量为发酵液的0.2-0.3。晶种要求纯度高、粒度均匀，投放晶种的目的是控制晶核数量，使晶体颗粒大，容易分离，提高收率。 第24页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一24E ：育晶养晶在pH4.5-5.0左右，一般就出现晶核，应停止加酸，搅拌育晶2小时晶不断溶解、在大结晶颗粒上聚集沉积的过程，可以使产品颗粒粗大。 F ：搅拌的影响 在不搅拌的情况下自然起晶，晶体的大小不均匀。采用缓慢冷却，适当搅拌。可使温度和pH均匀，有利于晶体长大，减少颗垃的互相

14、粘连使晶体均匀一致，避免晶接的形成。但搅拌太快，翻动激烈，会引起晶体的磨损，结果晶体细小；太馒，温度和pH值不均匀，局部晶核过多，晶体也会细小，搅拌转速与设备直径和搅拌桨叶大小有关，一般以20一30转分为宜。生产上采用桨式搅拌器，二挡交叉安装。 第25页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一25G：残糖的影响 发酵液残糖高，易产生型品体，因此残糖含量越低越好，有利于提高等电点结晶的收率。如残糖太高可适当增加高流分提高溶液中谷氨酸含量，以扩大谷氨酸与残糖之比值，有利于晶体的形成。 H：菌体的影响粪产碱杆菌发酵液中残存的菌体的大小及数量，因菌种不同而异。AS1.542菌发酵后，菌体

15、大，数量少，质量轻，易于分离；而Asl229菌体数量多而且重，难分离，故采用等电点提取谷氨酸时，宜用AS1.542菌。第26页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一26I ：染菌的影响 对于染菌和噬菌体感染都会降低纯度和收率，使操作围难，所以要防重于治，严格操作、酵液及时处理，保证新鲜不腐败。此外，发酵液中有L-天冬氨酸、苯丙氨酸等氨基酸存在时，能促进型晶体的生成，钙盐、镁盐等杂质对谷氨酸结晶也有影响，Ca2含量达到0.34克100毫升时就会影响谷氨酸的结晶析出。 第27页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一27为什么会有溶解度？盐析法又称中性盐沉淀法，在溶液

16、中加入中性盐能破坏蛋白质或酶的胶体性质，消除微粒上的电荷，促使蛋白质或酶沉淀，此法一般应用于蛋白质分离和酶制剂工业的发酵液提取。盐析原理 蛋白质或酶溶液是复杂的胶体系统，由两相组成：液体分散介质和固体分散内相(即分散物质)，分散内相的颗粒大小为1-100毫微米（纳米）。盐析法第28页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一28胶体溶液不是稳定的，在一定的条件下，它们的颗粒能相聚结而沉降。所以首先应对胶体溶液的形成有所了解： 在蛋白质或酶的颗粒表面分布着各种亲水基团，如-NH2，-OH，这些亲水基团吸聚着许多水分子，这种作用称为水合，水分子在颗粒表面形成一层水膜(溶剂化膜)，由于水

17、膜的存在，颗粒间被分隔开，水膜愈大，胶体溶液愈稳定。同时像蛋白酶等酶分子中，含有不同数目的酸性和碱性氨基酸，其肽链的两端有不同数目的自由羧基和氨基，这些基团使蛋白酶颗粒表面带有一定的电荷，因相同电荷的排斥作用，也使颗粒彼此分离，所以蛋白酶水溶液是一种稳定的亲水胶体溶液，如果在溶液中加入一定量的促淀剂，由于沉淀剂(NH4)2S04的亲水性比蛋白质或酶的亲水性大，它能与大量的水分子结合，使水膜退化、消失而脱水， 第29页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一29同时由于(NH4)2S04的解离，中和了蛋白质或酶颗粒所带的电荷，颗粒间失去相互的排斥力，在布朗运动的互相碰撞下，蛋白质或

18、酶分子结合成聚集物而沉淀析出，其机理可用图：第30页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一30从上述机理可见，蛋白质或酶的沉淀是由于盐类的加入使其溶解度变化所致，根据实际的观测，在浓盐溶液中蛋白质的溶解度和溶液离子强度呈下列关系：蛋白质的lgs 与离子强度 r/2关系图第31页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一31由图可见值为外推值，为蛋白质在纯水的溶解度对数值，它取决于蛋白质的种类，也和溶液的温度及pH值有关，与盐的种类无关。而K值主要由蛋白质的性质与盐的种类决定，而与溶液的pH和温度无关。因此用盐析法分离蛋白质时可以有两种步骤： 1在一定的pH及温度条件

19、下，改变盐的浓度(即离子强度)达到沉淀的目的，称为“K”分级盐析法。 2在一定的离子强度下，改变溶液的pH及温度达到沉淀的目的，称为“”分级盐析法。一般粗提蛋白质时常用第l法，进一步分离、纯化时常应用第2法。第32页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一32影响蛋白质盐析的主要因素： 影响蛋白质盐析的主要因素有盐析剂的种类和用量，溶液的温度和pH值。此外溶液中各种杂质的种类和数量，对蛋白质的溶解度都有直接的关系，这些关系是相当复杂而微妙的，具体问题必须通过实验加以解决。下面就一般情况加以介绍。 第33页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一33 A：盐析剂的种类

20、 可供选择的盐析剂种类很多，如MgSO4、(NH4)2S04、Na2S04、NaH2P04等，不同的盐其盐析效果是各不相同的。其中效果最好又最常用几种盐的盐析效果顺序如上。一般来说，含有多价阴离子的中性盐的盐析效果较好。但即便是同一种盐对不同品种的酶其盐析效果也不相同，具体情况必须具体分析。生产上最多用的盐析剂是硫酸铵，这是因为它在较低温度时，溶解度也相当高. B：盐析剂的用量 盐析剂的用量与所沉淀的酶的种类和酶液中杂质的性质、数量有关，应以收率最高的用量为标准。具体用量需通过对比试验和生产实践摸索才能确定。如目前生产 第34页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一34淀粉酶(

21、BF7658)，盐析剂硫酸铵的用量为40；而生产葡萄糖氧化酶、硫酸铵的用量需高达70。 由于硫酸铵用量大，且易吸湿结块，不易溶解，为了能够快速溶解，用前需加以粉碎，然后边溶解边加到酶液中，加盐的速度应尽可能避免盐析剂积聚罐底。搅拌能加快盐的溶解和加速胶体溶液的破坏，有利于酶的沉降，但强烈的搅拌会产生泡沫，引起酶蛋白质的表面变性和氧化使酶液活力下降，并且会使沉淀破碎，形成细小颗粒，沉降不完全，进而增加过滤的困难，所以应该适中。 C：盐析的温度 盐析时温度的选择要以不降低酶的活力为原则，应在其保持稳定的温度范围内进行盐析，但也需适当地顾及盐析效果，可以根据实验结果决定，一般规律是温度愈低沉淀的形成

22、愈不容易但也有相反的情况。实际上可供选择的 第35页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一35范围较大，所以多数是在常温下进行盐析。 D：盐析的pH值 盐析的pH选择也要以不降低酶的活力为原则。同样也要通过试验决定，加盐后的酶液形成沉淀的pH值(等电点)与原来酶液相比改变不大。由于蛋白质在等电点时最易沉淀，故可选择等电点的pH值作为盐析的pH值。但为防pH值对酶活力的影响，可通过试验选择在酶稳定的pH范围内进行盐析。 E：溶液中杂质的影响 酶液中杂质的组成以及这些成分对盐衍效果的影响是极为复杂的，尤其是溶液中所含的各种蛋白质和其它酶对需要提取的酶会相互作用。盐析条件的选择应以最

23、大可能沉淀出需要的酶为原则，要通过试验具体选择。此外，特别重要的是重金属离子的影响，重金属的存在会导致酶的大量损失。例如，所用器具产生铜锈可使酶活力大幅度 第36页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一36降低，根据试验，十万分之一的硫酸铜会使脂肪酶的活力损失90左右。人为因素带来的杂质应当尽量避免，发酵液的贮放不能太久应及时处理，否则进一步发酵和杂菌孳生都会降低酶液的活力。第37页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一37用硫酸铵盐析法生产蛋白酶制剂 嗜碱性芽孢杆菌分泌 第38页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一38有机溶剂沉淀法 有机溶剂

24、沉淀法常应用于酶制剂、氨基酸、抗生素等发酵产物的提取上。下面我们谈酶的有机溶剂沉淀法。有机溶剂沉淀原理 有机溶剂如丙酮、乙醇、甲醇等使蛋白质、酶等沉淀，早期人们认为是由于加入溶剂后，使溶液的介电常数降低，因而使蛋白质或酶分子间静电引力(库仑力)增大。后来又提出了另一种说法，认为是由于蛋白质或酶的溶剂化，使原来和蛋白质或酶结合的水为溶剂所取代因而降低了它们的溶解度，但是这种理论不能说明许多问题。 第39页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一39 何以丙酮、乙醇之类溶剂在所谓脱去蛋白质或酶水膜的过程中容易使它们变性、而盐析脱水时不造成它们的变性呢?事实证明丙酮、乙醇等有机溶剂不仅

25、是蛋白质或酶的沉淀剂，更重要的还是它们的一种变性剂，可见有机溶剂使蛋白质或酶沉淀和变性之间有区别又相关联。 近来对蛋白质或酶变性的研究有所发展，有可能对有机溶剂沉淀蛋白质或酶的机理作出新的探索，有机溶剂可能破坏蛋白质或酶的某种键如氢键，使其空间结构发生某种程度的变形，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成硫水层，从而使蛋白质或酶沉淀，当蛋白质或配的空间结构发生变形超过一定程度就会导致完全的变性。可见，必须把有机溶剂使蛋白质或酶沉淀和变性之间的关系有机地结合起来，才能正确地阐明其机理。第40页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一40有机溶剂沉淀法

26、的优点是某些蛋白质沉淀的浓度范围相当广，所得产品的纯度较高，从沉淀的蛋白质或酶中除去有机溶剂是很方便的，而且有机溶剂本身可部分地作为它们的杀菌剂，因而使有机溶剂法有可能用于大规模的蛋白质分级过程中。缺点是需要耗用大量的溶剂，溶剂的来源，库存都比较困难或麻烦，并且提炼操作需在低温下进行，使用上有一定的局限性也比盐析法低。影响沉淀的因素 有机溶剂沉淀法其影响的因素是多方面的，如溶剂的种类和用量、沉淀的温度、pH值和时间，溶液中的盐类，吸附剂的性质和用量等。不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率，受蛋白质的种类、温度、pH和杂质等因素所影响，但大致上以丙酮为最佳，乙醇次之，甲醇更次，具体要通过试验加以选择。第

27、41页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一41 乙醇是最常用的沉淀剂在沉淀过程中乙醇与水混合时放出大量的稀释热，使溶液的温度显著升高。对不耐热的酶影响较大，生产上常用搅拌、少量多次加入的办法，以避免温度骤然升高损失酶活力。有机溶剂对酶的沉淀能力也受到温度的影响，一般温度越低沉淀越完全，所以沉淀过程必须注意冷却降温，使沉淀在较低的温度下进行。 用有机溶剂沉淀酶类有产生变性的可能，尤其是在还没有沉淀之前，这种可能性更大。所以在加溶剂时要搅拌均匀，其量不能一下子过多，以防局部浓度过高，引起酶的失活，并且又要在形成沉淀之前，尽可能快速加完，以缩短溶剂与酶的接触时间，沉淀完全后，应立即

28、压滤和烘干，尽快除去湿酶中的有机溶剂。 在沉淀过程中，加入一些对酶有保护作用的盐类，对减少酶活的损失，提高收率十分有利，并且还可以使沉淀物凝聚而易于过滤。所以在酶沉淀前先用适量的磷酸二氢钠 Why?第42页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一42和氯化钙进行热处理，再用乙醇沉淀，有利于过滤的进行。 如果在有机溶剂沉淀的同时还用吸附的办法，则要注意吸附剂及其用量和吸附温度的选择：由于酶的作用，底物对酶有保护作用，所以一般采用底物作吸附剂，不同吸附剂的吸附能力不同，在用淀粉作吸附剂时，玉米淀粉的吸附力较大，应采用增加吸附剂用量和在较低温度下吸附，则效果较好。以湿淀粉作吸附剂时、应

29、先经80-l00加热或加l0硫酸钠于98处理，20分钟后使用。 从上可见，无论是盐析法，还是有机溶剂法沉淀产物都存在着一定的问题，所以近年来采用可溶性天然或合成的聚合物和多聚电解质来沉淀产物，此法在回收、精制中起着愈来愈大作用。第43页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一43A 多聚电解质法 聚乙烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素等。如用聚丙烯酸可逆沉淀蛋白质的现象，可以作为分离和精制某些酶工业技术的基础(乳糖酶、溶菌酶、淀粉酶等等)，这些沉淀剂的作用，同离子交换色谱一样，与蛋白质上的净电荷以及聚电解质的大小和电荷密度有关，蛋白质分子的相反电荷与聚电解质结合，形成一个多分

30、子络合物，当络合物超过游离蛋白质的溶解度极限值时，就发生沉淀。B 水溶性非离子型聚合物法 用聚乙二醇沉淀酵母的酶浸出液研究表明，离子强度以及溶液的pH和蛋白质的浓度响应这个过程。在蛋白质浓度相当低时发生分级，在蛋白质浓度高时发生通常的沉淀。 聚电解质沉淀法第44页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一44显然使用聚乙二醇比盐析要好。在工业规模上用聚乙二醇分级已成功地应用在制取高纯度的L-天门冬酰胺酶上收率为83.7。 除了上述列举的沉淀蛋白质的聚合物以外，还有其它的带电聚合物，如DEAE-右旋葡糖，聚乙烯胺，右旋葡糖和精朊的硫酸盐等等。 第45页，共76页，2022年，5月20

31、日，11点1分，星期一45金属离子沉淀法金属离子的沉淀作用是由子它们能与蛋白质分子中的特殊部位起反应造成的。例如锌易与组胺酸残基中的咪唑基结合，使蛋白质的等电点转移，从而降低蛋白质的溶解度。金属离子沉淀蛋白质，一般可分为三类：第一类为能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的一些金属离子，如Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+；第二类为能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子，如Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+；第三类为与疏基化合物强烈结合的一些金属离子，如Hg2+、Ag+、Pb2+。实际应用时，金属离子的浓度常为0.02mol/L。复合

32、物中金属离子的去除，可用离子交换法或EDTA金属螯合剂。第46页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一46例子：四环素类抗生素在碱性条件下能和钙、镁、钡等重金属离子或溴代十五烷基吡啶生成沉淀；青霉素可与N，N二苄基乙二胺、三乙胺、N乙基吡啶和环己胺等有机碱形成难溶的盐；新霉素可以和强碱性表面活性剂、环杆菌素可用工业阴离子去污剂形成难溶性复合物等等 第47页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一47 亲和沉淀是分离过程的一部分，但是其沉淀原理与通常的沉淀方法有很大的不同。它是利用蛋白质与特定的生物的或合成的分子(免疫配位体、基质、辅酶等)之间高度专一的相互作用而设

33、计出来的一种特殊选择性的分离技术，所以其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据“吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。亲和过程提供了一个从复杂混合物中分离提取出单一产品的有效方法。这个技术包含有三个步骤：在初始阶段，将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲和配位体络合形成沉淀；所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质；用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体中离解出来。亲和沉淀第48页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一48核酸的分离和纯化 （附影像教材）核酸分离的步骤。1.溶解细胞 溶解细胞的方法因标本不同而不同。有的是用十二烷基硫酸钠（sodium

34、 dodecyl sulfate,SDS）加NaOH，有的是用蛋白酶，有的用超声波破碎等方法。2有机溶剂抽提 利用苯酚提取主要使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，达到分离核酸的目的。实际上生物标本中含量最多的就是蛋白质。3.纯化 为了得到纯的核酸，可用蛋白酶除去蛋白；用RNA酶除去RNA，得到纯的DNA；用DNA酶除去DNA，得到纯的RNA。4.沉淀 为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是加冷乙醇和盐沉淀核酸，再通过离心回收核酸，然后用80%乙醇洗涤沉淀，除去多余的盐，以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应。第49页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一49沉

35、淀法在中草药提取中的应用沉淀法是在中草药提取液中加入某些试剂使其析出其中某种或某些成分，或析出其杂质，产生沉淀，以获得有效成分或除去杂质的方法，包括醇沉法、酸碱沉淀法、铅盐沉淀法等。 1醇沉法 中草药的水提液中常含有树胶、黏液质、蛋白质、淀粉等，可以加入一定量的乙醇，使这些不溶于乙醇的成分从溶液中沉淀析出，而达到与其他成分分离的目的。例如自中草药提取液中除去这些杂质，或从白及水提液中获得白及胶，都是采用乙醇沉淀法。丙酮在蛋白质、多糖的提取中也常做沉淀试剂，如自新鲜栝楼根汁中制取天花粉蛋白，可滴入丙酮使分次沉淀析出。另外，提取多糖及多肪类化合物，也多采用水溶解、浓缩、加乙醇或丙酮析出的办法。 第

36、50页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一50实例1 栝楼中天花粉蛋白的分离 取新鲜栝楼根刨去表皮，压汁，汁液放置过夜后离心，上清液加等量乙醇有沉淀析出，离心除去，母液再加0.5倍量乙醇，离心收集此部分沉淀，仍含杂质。再于此母液中加1倍量的乙醇，则析出较纯的蛋白质沉淀，蛋白质用水溶解，冷冻干燥，即为天花粉蛋白纯品。 第51页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一512酸碱沉淀法 酸碱沉淀法是利用某些成分能在酸或碱液中溶解，当加碱或加酸调整溶 液的pH后，所需成分又恢复回原来结构，成不溶物而析出以达到分离的目 的(具体操作见溶剂分离法)。 实例2 蝙蝠葛中提取蝙

37、蝠葛碱 取蝙蝠葛粗粉，以0.55的硫酸水溶液温热浸提2次，合并提取液，用浓氨水碱化至pH 9.0一9.5，然后用苯萃取，合并苯液，再以2的盐酸萃取苯溶液，合并酸水萃取液，用氨水调pH为9，产生沉淀，过滤，水洗至 中性，60下烘干，即得蝙蝠葛碱成品。 第52页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一523铅盐沉淀法 铅盐沉淀法是分离某些中草药成分的经典方法之一。由于中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水及醇溶液中，能与多种中草药成分生成难溶的铅盐或络合物沉淀，故可利用这种性质使右效成分与杂质分离。中性醋酸铅能与酸性成分或某些酚类物质结合成不溶性铅盐。因此常用于沉淀有机酸、氨基酸、蛋 白质、黏液

38、质、鞣质、树脂、酸性皂苷、部分黄酮等。碱式醋酸铅产生不溶性铅盐或络合物的范围更广。通常将中草药的第53页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一53水或酸提液先加入醋酸铅浓溶液，静置后滤出沉淀。然后将铅盐沉淀悬浮于新溶剂中，通以硫化氢气体， 使铅转为不溶性硫化铅而沉淀除去。硫化氢脱铅比较彻底，但溶液中多余的硫化氢，必须通人空气或二氧化碳让气泡带出，以免在处理溶液时参与化学 反应。新生态的硫化铅多为胶体沉淀，能吸附药液中的有效成分，要注意用溶剂处理收回。另外，也可用硫酸、磷酸、硫酸钠、磷酸钠等方法除铅，但不如硫化氢除铅彻底。阳离子交换树脂也可以用来脱铅，快而彻底，但药液中某些有效成

39、分也可能被交换上去，造成吸附损失。 第54页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一54实例3 槲树皮中槲皮苷的提取 槲树(Qucercus dentata Thunb)皮的乙醇提取液，先加入少量中性醋酸铅溶液，搅拌均匀，析出暗棕色沉淀，滤除沉淀(含大量杂质和少量槲皮苷)，于滤液中继续加入中性醋酸铅溶液至不再产生橙黄色沉淀。过滤收集沉淀，洗净后，悬浮于乙醇中，通入硫化氢至铅盐全部分解过滤，蒸干滤液，得黄色残渣，溶于热水中，滤除不溶物，放冷，槲皮苷即结晶析出。第55页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一55 除上述沉淀方法外，蛋白质还可以等电点沉淀析出，如某些蛋白

40、质溶液，可以变更溶液的PH、利用其在等电点时溶解度最小的性质而使之沉淀析出。此外，还可以用明胶、蛋白溶液沉淀鞣质；胆甾醇也常用以沉淀洋地黄皂苷等。沉淀试剂可根据中草药有效成分和杂质的性质，适当选用。 作为一种初步的纯化方法沉淀法也经常被用在皂苷的研究中，将含有皂苷的提取物(如经丁醇-水分配之后)的浓缩的甲醇溶液倒人大量的乙醚中，利用过滤或离心的方法收集沉淀的皂苷，反复利用这种方法，可以得到很好的分离效果(Hostettmann和Marston，l995)。第56页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一56盐析法是在中草药的水提液中加入无机盐使之达到一定的浓度或半饱和或饱和状态后

41、，可使提取液中的某些成分在水中的溶解度降低而沉淀析出， 从而达到与水溶性大的杂质分开的种分离方法。一般的生物碱、皂苷、挥发油等都可用盐析从水溶液中分离出来。常用作盐析的无机盐有氯化钠、氯 化钾、氯化钙、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵、碳酸钾等。例如在三七的水提取液中加硫酸镁至饱和状态，三七皂苷乙即可沉淀析出；从大麦中提取淀粉酶也是加入硫酸铵盐析；从黄藤中提取掌叶防己碱，三颗针中提取小蘖碱都可用氯化钠或硫酸铵盐析制备；有些水溶性较大的成分如原白头翁素、麻黄碱、苦参碱等，在提取时，亦往往先在水提取液中加入一定量的氯化钠，再用有机溶剂萃取。 第57页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一57

42、实例4 大麦中提取淀粉酶大麦（hordeum vulgare)种子在25-27发芽7d，麦芽捣碎，压汁，在汁液中加入硫酸铵盐析，沉淀物冷冻干燥，磨粉。即为淀粉酶。第58页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一58利用物质挥发性的差异分离共存组分。挥发法是将气体和挥发组分从液体或固体样品中转变气相的过程，它包括蒸发、蒸馏、升华、气体发生和驱气，有时有称之为气态分离法。蒸馏主要用于物质组分的分离提纯或制备。蒸馏与挥发第59页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一59第60页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一60一、 蒸馏蒸馏是基于气液平衡的原理将

43、物质的组分分离。蒸气相的富集程度随二组分相对蒸气压的大小而定。简单的蒸馏技术只能使二组分部分分离，没有一相是纯净的。分馏技术可将二组分分离并得到所需的纯度。第61页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一61普通蒸馏法基于物质的挥发性和沸点的差异进行分离是最常用的制备和提纯试剂的方法实验室中常用蒸馏法提纯盐酸、硝酸、氢溴酸、氢碘酸、高氯酸和硫酸等。 第62页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一62亚沸蒸馏技术亚沸蒸馏是近代发展起来的蒸馏技术。该方法主要持点是用红外灯或电热丝从上方加热提纯液态物质，使液体在低于沸点条件下表面蒸发，从而避免沸腾状态下气泡自液体底部上

44、升，使母液的雾状颗粒不致于带入馏出液中。常用石英亚沸蒸馏器提纯水、盐酸、硝酸、高氯酸，用聚四氟乙烯亚沸蒸馏器提纯氢氟酸。第63页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一63第64页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一644. 利用形成恒沸混合物的蒸馏例：乙醇与水的分离95%乙醇5H2O，恒沸点78。加苯作为夹带剂形成一沸点更低的的恒沸点混合物，除去5的水。第65页，共76页，2022年，5月20日，11点1分，星期一65二、 挥发分离 两大类： (1)直接蒸馏挥发一种或一种以上的组分。 主要用于挥发性相差悬殊的组分。 (2)将各组分转化为具有不同挥发性的化合物。在适当温度下用活性气态试剂处理、使主要组分或痕量组分可以蒸馏挥发；用适当的方法分解样品，使有关组分转化为易挥发的化合物。最常见的试剂是氟、氯、溴或者卤化氢等。第66页，共