医学免疫学课件：凝集和沉淀反应

1、凝集和沉淀反应定义： 细菌、螺旋体、红细胞或细胞性抗原等颗粒性抗原，或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒后，在适当电解质存在下，它们与相应抗体（或抗原）发生特异性反应，形成肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应凝集反应(Agglutination)效价或滴度(Titer): 将标本进行一系列对比稀释后，与相应抗体反应，进行检测，以出现阳性反应的最高稀释度进行半定量检测凝集反应凝集反应的发生分为： 抗原抗体的特异结合 出现肉眼可见的颗粒凝集 凝集反应是一个定性检测方法凝集反应包括： 直接凝集反应和间接凝集反应两大类第一节 凝集反应的特点第一节 直接凝集技术 （Direct agglutina

2、tion test)第二节 间接凝集技术 ( Indirect agglutination test)第三节 其它凝集技术凝集反应直接凝集试验: 细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体反应，出现凝集现象凝集原(Agglutinogen):凝集反应中的抗原凝集素(Agglutinin):参与凝集反应的抗体第二节 直接凝集技术(Slide agglutination test)原理： 通常以已知抗体作为诊断血清，与待 测颗粒抗原在电解质存在下，作用一定时间，通过凝集与否，进行细菌或红细胞定性（或定型）方法评价：特异性强、简便、快速一、玻片凝集试验原理： 已知的细菌或红

3、细胞等颗粒性抗原与相应抗体在试管中直接凝集的半定量试验，多用来测定抗体方法评价： 特异性易受条件影响，敏感性不高临床应用： 外斐试验、肥达试验、交叉配血试验(Tube agglutination test)二、试管凝集试验包含内容： 一、载体种类及其处理方法 二、间接凝集技术类型 三、间接血凝试验 四、胶乳凝集试验 五、间接凝集试验的应用第三节 间接凝集技术间接凝集试验： 用人工方法将可溶性抗原(或抗体）吸附或偶联于载体上，使之成为致敏载体颗粒，再与相应抗体（或抗原）作用，在适宜电解质存在条件下，出现特异性的凝集现象间接凝集试验概念载体(Carrier)： 试验体系中与免疫无关的大小适当的颗粒

4、致敏(Sensitized): 抗原(或抗体)偶联于颗粒表面的过程致敏颗粒 (Sensitized particle): 吸附有已知抗原或抗体的颗粒相关概念缓慢2.5%的OHC-(CH2)3-CHO(戊二醛)室温下搅拌2h用PBS稀释成0.5%红细胞悬液OHC-(CH2)3-HC=抗原(或抗体)-NH2的缓冲液* 电磁搅拌N-抗原(或抗体)* 抗原于pH7.2PBS中进行；抗体于pH4.0醋酸中进行 加入 红细胞载体制备一、载体种类及其处理方法离心聚苯乙烯胶乳-抗原(或抗体)过量抗原(或抗体)抗原-聚苯乙烯胶乳的絮状凝集性能不稳定，容易解离。 混合聚苯乙烯胶乳中和聚苯乙烯胶乳表面电荷除去游离配

5、体胶乳颗粒物理交联法pH值7.08.2的PBS，离子强度0.05，孵育45min增大配体与载体表面的距离聚苯乙烯胶乳-CO-NH-抗原(或抗体)减少空间位阻氨基己酸抗原(或抗体)-NH2性能稳定，保存时间长，特异性、敏感性优于物理法。 混合羧化聚苯乙烯胶乳碳化二亚胺缩合成胶乳颗粒化学交联法根据致敏用的试剂和反应方式分为2.反向间接凝集试验 (Reverse indirect agglutination test)3.间接凝集抑制试验 (Indirect agglutination inhibition test)1.(正向)间接凝集试验 （Indirect agglutination test

6、)二、间接凝集技术类型载体可溶性抗原致敏致敏颗粒NS凝集颗粒用特异性抗原致敏载体，检测标本中的相应抗体的方法待测抗体(正向)间接凝集试验用特异性抗体致敏载体，检测标本中的相应抗原的方法载体已知抗体致敏致敏颗粒NS凝集颗粒待测抗原反向间接凝集试验待测抗原已知抗体无结合抗原抗体分散NS致敏颗粒有凝集颗粒为阴性间接凝集抑制试验将待测样品中的抗原与已知抗体作用后，再与相应抗原-乳胶颗粒混合。因没有游离抗体的存在，乳胶颗粒表面的抗原不能与抗体结合出现凝集现象，即凝集被抑制如：孕妇尿液中含HCG，用抗HCG与之结合后，再加HCG-乳胶，则不出现凝集现象待测抗原已知抗体无结合抗原抗体分散NS致敏颗粒有凝集颗

7、粒为阴性间接凝集抑制试验用抗原致敏载体及相应抗体作为诊断试剂，用于检测标本中是否存在与致敏载体相同的抗原待测抗原已知抗体特异结合抗原抗体复合物NS致敏颗粒无凝集颗粒为阳性用抗原致敏载体及相应抗体作为诊断试剂，用于检测标本中是否存在与致敏载体相同的抗原间接凝集抑制试验正向间接 已知抗原 无 抗体 胶乳凝集 凝集试验 致敏载体 RBC凝集致敏颗粒 第二试剂 待测物 阳性结果间接凝集 已知抗原 抗体 抗原 胶乳不凝集 抑制试验 （或抗体） （或抗原 ） 抗体 胶乳不凝集 致敏载体 阴性结果凝集反向间接 已知抗体 无 抗原 胶乳凝集 凝集试验 致敏载体 RBC凝集 * 间接凝集抑制试验：需要先加入已知

8、与致敏颗粒相同的抗原(或抗体) 进行中和。间接凝集试验比较（Indirect hemagglutination test)原理： 用已知的可溶性抗原(或抗体）吸附人的“O”型血红细胞、绵羊或家兔的红细胞，制成致敏血红细胞,与相应抗体（或抗原）作用，在适宜电解质参与下，出现红细胞凝集现象。方法评价： 敏感性较强、简便、快速、成本低廉三、间接血凝试验(被动血凝试验)红细胞抗原致敏致敏红细胞NS红细胞凝集待测抗体间接血凝试验结果示意图-+间接血凝试验原理： 将可溶性抗原(或抗体）与胶乳结合后，直接与待测标本中相应抗体（或抗原）发生凝集反应方法评价： 1.胶乳颗粒的性能比RBC稳定、均一性好 2.与抗

9、原结合的能力及凝集性能不如RBC 四、胶乳凝集试验1. 抗体的检测 检测细菌、病毒、寄生虫感染后产生的抗体及自身抗体和药物抗体 自身免疫病患者的抗体的检测 变态反应患者的抗体的检测2. 抗原的检测 较少使用五、间接凝集试验的应用一、抗球蛋白试验 (Antiglobulin test)二、协同凝集试验 (Coagglutination test) 三、冷凝集试验 (Cold agglutination test)四、自身红细胞凝集试验 (Auto-erythrocyteagglutinationtest )第四节 其它凝集技术类型：(Antiglobulin test) 1.直接法 2.间接法一

10、、抗球蛋白试验(Coombs试验) 原理： 把产生“不完全抗体”的机体正常血清球蛋白，注射到异种动物，使其产生抗球蛋白。此种抗球蛋白加入表面结合有不完全抗体的红细胞的复合物中，就能出现可见的凝集现象作用：检测红细胞表面结合的不完全抗体临床意义：新生儿溶血症和自身免疫性溶血性贫血的诊断RBC为Rh+7S的IgG体内发生+抗IgG体外测试抽血1. Coombs试验直接法 作用：检测游离在血清中的不完全抗体临床意义：输血前的交叉配血、不相溶输血后的抗体检测。检测母体 Rh（D）抗体有助于及早发现及避免新生儿溶血症RBC为Rh+不完全抗体+抗IgG体外测试2. Coombs试验间接法 特点： 自身红细

11、胞凝集试验与一般间接血凝试验不同之处为反应中的红细胞是未经致敏的受检者新鲜红细胞临床应用： HIV、HBsAg的检测二、自身红细胞凝集试验(Auto-erythrocyteagglutination test )二、自身红细胞凝集试验(Auto-erythrocyteagglutination test )血液标本中的红细胞和抗原(或抗体)分别与试剂中的抗红细胞单克隆抗体和特异性抗体(或抗原)反应，形成网络而导致红细胞的凝集。(Coagglutination test)原理： SPA(葡萄球菌A蛋白)能与血清中的IgG类抗体的Fc段非特异性结合，而两个Fab段暴露在葡萄球菌菌体表面，仍然保持正

12、常的抗体活性，与特异性抗原相遇时，能出现特异的凝集现象应用： 微生物的快速诊断、定种及定型；以协助传染病的早期诊断三、协同凝集试验IgGSPASPA- IgG 待测抗原SPA- IgG-待测抗原凝集颗粒混合 加入协同凝集试验原理概念：冷凝集素是红细胞某些抗原的自身抗体，只能在低温时与其相应的抗原结合 (Cold Agglutination test)原理：冷凝集反应在4时最强烈，红细胞凝集最明显；温度升高后，抗原抗体复合物解离，凝块消失意义：冷凝集素增高常见于：单核细胞增多症和支原体肺炎，恶性淋巴瘤呈现慢性增高四、冷凝集试验抗原表位隐含，不能与抗体结合混合暴露表位的抗原表位与抗体结合混合374

13、37冷凝集试验原理 第一节 液相内沉淀试验 第二节 凝胶内沉淀试验 第三节 免疫电泳技术 第四节 免疫浊度分析技术沉淀反应沉淀反应:(precipitation)液相内沉淀试验：凝胶内沉淀试验：可溶性抗原与相应抗体,在适宜条件下发生特异性结合,所出现的沉淀现象指抗原抗体在以生理盐水或其它无机盐缓冲液为反应介质的液相内自由接触,短时间可出现反应指抗原抗体在琼脂糖内扩散或凝胶内扩散试验沉淀反应概念一、絮状沉淀试验： (Flocculation test)二、环状沉淀试验: (Ring precipitation test)三、免疫浊度试验: (Immunoturbidimetry)第一节 液相沉淀

14、试验抗原溶液与相应抗体溶液混合,在电解质存在下,抗原与抗体结合出现可见的絮状沉淀技术类型1 抗原稀释法方法评价和应用：原理3 棋盘格法2 抗体稀释法用于测定抗原抗体反应的最适比敏感度较低、简便、易受抗原抗体比例影响最适比.一、絮状沉淀试验1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀释加入抗血清各管抗体量不变振摇 混匀、37孵育沉淀量不同出现沉淀量最多的管为最适比例管。轻摇絮状沉示意图淀AgAbAg表1. 最适比的方阵测定法抗体稀释度抗原稀释度1/101/201/401/801/1601/3201/640对照1/5+-1/10+-1/20+-1/40-+-1/80-+-从表

15、1 可看出方阵法可较正确找出抗原与抗体的最适比.如抗体用 1:40 ,抗原则 1:320 稀释如抗原是 1:160 ,抗体则用 1:20 恰当.注: “+”为沉淀物; “+”为最适比. 3.棋盘格法(方阵法): 用恒定的抗原量与不同程度稀释的抗体反应，计算结果同上法，得出的是抗体结合价和最适比 抗原和抗体同时稀释，可一次完成抗原和抗体的滴定，并找出抗原和抗体的最适比2.抗体稀释法:一、絮状沉淀试验敏感度较低、只能定性不能定量、缺乏多对分辨力；但是简便、快速、实用；鉴定血迹、诊断炭疽把抗原液小心加于已含抗体液的细试管液面上,当对应抗原与抗体相遇时,在界面处形成清晰的乳白色沉淀环方法评价和应用：原

16、理(ring precipitation test)二、环状沉淀试验AbAg环状沉淀示意图沉淀管内径1.52mm15min出现沉淀环为阳性30min不出现沉淀环为阴性操作步骤可对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定当可溶性抗原与相应的抗体在二者比例合适时特异结合，在特殊的缓冲液中快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液出现浊度方法评价和应用：原理(Immunoturbidimetry)三、免疫浊度试验一、单向琼脂扩散试验: (Single gel diffusion test)二、双向琼脂扩散试验： (Double gel diffusion test)第二

17、节 凝胶内沉淀试验 敏感度1.25mg/L、稳定、简便、重复性和线性均好将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测抗原在凝胶中自由扩散，与相应抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗原浓度呈正相关方法评价原理(single gel diffusion test)一、单项琼脂扩散试验（沉淀环直径)2抗原浓度1.抗体混于凝胶中2.抗原加入孔内3.抗原自由扩散标准品抗原浓度测定不同病人抗原浓度测定1.测定沉淀环直径2.在标准曲线上查找 相应抗原浓度一、单项琼脂扩散试验一、单项琼脂扩散试验 1.抗原分子量：与扩散速度、沉淀环反相关 6.琼脂板厚度：与沉淀环反相关 2.抗体种类：兔抗血清优于马、羊 3.抗体稀释度：

18、抗体浓度大沉淀环小 4.扩散时间：抗原含量高，扩散时间长 5.扩散温度：437内温度与扩散速度正相关一、单项琼脂扩散试验影响因素稳定、简便、但灵敏度稍差将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中,两者各自在凝胶中向四周自由扩散,当抗原与抗体相遇,在比例合适时形成沉淀线方法评价原理(double gel diffusion test)应用1.检测未知抗原或抗体3.抗体效价滴定4.抗原或抗体纯度鉴定2.抗原性质分析二、双向琼脂扩散试验AbAg染色标本图1.抗原抗体双向自由扩散2.24小时出结果3.呈现沉淀线或弧双向琼脂扩散试验-原理示意图双向琼脂扩散试验-原理示意图AgAbA B C D E F A：浓度Ag、Ab及扩散率近似； B：浓度Ag、Ab近似，扩散率AgAb ； C：浓度Ag、Ab近似，扩散率AgAb ； D：浓度AgAb，扩散率近似； E：浓度AgAb，扩