免疫化学实验操作指导书：免疫血清的制备

1、PAGE PAGE 269实验十三 免疫化学实验 免疫化学实验包括免疫血清的制备、沉淀反应定量法、对流免疫电泳、单向定量免疫电泳（火箭电泳）、双向定量免疫电泳（交叉免疫电泳）、微量免疫电泳以及单向双向免疫扩散、酶联免疫吸附测定等。从内容上看这几个实验具有一定的连贯性，是免疫化学最基本的实验方法。 实验(一) 免疫血清的制备一. 实验目的：制备抗特定抗原的动物抗血清。二. 器材与试剂： 1. 实验动物：兔子（25003000克） 2. 抗原：（小牛血清） 3. 佐剂：福氏完全佐剂 4. 乳化搅拌器 5. 注射器及针头 6. 手术器械：剪刀，手术刀，线，血管钳，塑料导管（2mm） 7. 恒温箱 8

2、. 离心机及离心管 9. 三角瓶（100ml） 10. 酒精棉球 11. 叠氮化钠(NaN3)12. pH 7.2磷酸缓冲生理盐水（PBS）三. 实验方法 制备高效价和高特异性的免疫血清是免疫化学实验的第一步，免疫血清也是免疫学实验必不可少的生物制剂。实验程序包括动物免疫注射，抗血清效价的测定，全部放血及血清的分离与保存四步。 1.免疫兔子免疫周次不完全佐剂(ml) 抗原小牛血清(ml) PBS(ml)灭活结核杆菌免疫用量 ml/只 注射部位石蜡油 羊毛脂一0.51.51.50.50.1-0.2mg/ml 2四只脚掌二0.51.511 2腋窝 腹股沟 脊背三11 2腹腔四0.30.2 0.5耳

3、缘静脉福氏完全佐剂常用的制备方法有研磨法和注射器法两种。研磨法方法如下：将经高压除菌的石蜡油0.5ml和羊毛脂1.5ml放入无菌的乳钵内，再慢慢滴入小牛血清。PBS及已灭活的结核杆菌，边滴边研磨，直至成为乳白色粘稠的油包水乳剂。检验方法是取一滴乳剂滴入水面（冷水），如不扩散，则完全佐剂已研磨成功。此配方为一只兔子的免疫用量，也可按比例多组联合研磨。 注射器法：将两个注射器中间接上一根短的胶皮，注射器左右推拉，使注射器内的溶剂充分乳化，直至形成油包水乳剂。2. 免疫血清效价的测定第四周时通过耳缘静脉采血1ml，先将血液置室温30分钟，离心（3500rpm）10分钟，取出血清。用双向免疫扩散法测定

4、抗血清的效价，以确定免疫效果。3. 颈动脉采血将禁食12小时或隔夜的兔子仰面固定于固定板上，头部放低，暴露出颈部，剪开颈中部皮肤，约10cm长。沿气管分离皮下组织，直至暴露气管前的胸锁乳突肌。仔细分开胸锁乳突肌（注意勿剪断小血管），在肌束下面靠近气管两侧，可以看到搏动的颈动脉。取二把血管钳在血管的远心端（近头部）夹紧，一把夹住近心端的血管（在近心端用线扎好与血管相连的神经，然后用剪子在二把血管钳中间的血管上剪一小口插入塑料放血管（用线固定），轻轻放开近心端的止血钳，使血很快射入三角瓶中。直至血流缓慢时（也可用同法在另一侧动脉内插管放血）将固定板后肢端抬高，增加放血量。将三角瓶盖好，放置室温一小

5、时，再放4过夜，待血块收缩后分离血清（离心3500rpm,10分钟）。4血清的保存如要长时间存放，56灭活，在血清里添加0.1%叠氮化钠，将血清进行小量分装，放置低温冰箱内保存。Some commonly used adjuvantsAdjuvantComposition and useFreunds complete adjuvant(FCA)Mineral oil containing heat-killed mycobacteria(Mycobacterium tuberculosis)Used as emulsion with aqueous antigenFreunds incomp

6、lete adjuvant(FIA)Mineral oilUsed as emulsion with aqueous antigenAlumComplex aluminium salts. There are various versions of the adjuvant: some can be purchased ready for use(e.g. Alhydrogel); others can be prepared in the laboratory by mixing various salts, e.g. NaHCO3, and aluminium potassium sulp

7、hate. Aqueous antigen is absorbed to gelBentonite Wyoming sodium bentonite(Montmorillonite) as gel. Aqueous antigen adsorbed to surfaceQuil ASaponin derived from Quillaja saponana Molina(South American tree). Mixed to form a complex with aqueous antigen.Muramyl dipeptide(MDP)N-Acetylmuramyl-L-alanyl

8、-D-isoglutamine. Mixed with aqueous antigen. Various derivations of MDP are aqueous antigenMonophosphoryl lipid A(MPL)Used in various formulations, often as an emulsion with oils. Antigen included in emulsionBacillus pertussisKilled organisms mixed with aqueous antigenFCA is probably the most potent

9、 adjuvant but may be inappropriate for some purposes.Source: Reproduced from M.A.Kerr and R.Thorpe, Immunochemistry Labfax(1994), Bios Scientific, Oxford.Examples of immunization protocols that have been used successfullySpeciesPrimingRest period(weeks)First boostRest period(weeks)Subsequent boostsM

10、ice, rats and guinea pigs5-100g antigen in FCA or other adjuvant, s.c. or i.m.2-350-100g antigen in FIA, other adjuvant or PBS, i.m. or s.c.35-100g antigen in FIA or PBS, i.p., s.c., i.m. or i.v.Rabbits50-250g antigen in FCA or other adjuvant, i.d., i.m. or s.c.3-450-250g antigen in FIA or other adj

11、uvant or PBS, i.m., or s.c.4 or longer50-250g antigen in FIA or PBS, i.m., s.c. or i.v.Sheep and goats 250g-10mg antigen in FCA or other adjuvant, i.m.,s.c. or i.d.4250g-10mg antigen in FIA or other adjuvant, i.m.or s.c. 4-8 or longer250g-10mg antigen in FIA or other adjuvant, i.m., s.c.or i.v.Horse

12、s and donkeys250g-50mg antigen in FCA or other adjuvant, i.m.,s.c. or i.d.4250g-50mg antigen in FIA or other adjuvant, i.m.or s.c.4-8 or longer250g-50mg antigen in FIA or other adjuvant, i.m.or s.c.Primates50g-1mg antigen in adjuvant, i.m. or s.c.50g-1mg antigen in adjuvant or PBS, i.m., s.c.or i.v.

13、4-8 or longer50g-1mg antigen in adjuvant or PBS, i.m., s.c.or i.d.Chickens30-200g antigen in FCA or other adjuvant, i.m.2-330-200g antigen in FIA or other adjuvant, i.m.3 or longer30-200g antigen in FIA or other adjuvant or PBS, i.m.FCA, Freunds complete adjuvant; FIA, Freunds incomplete adjuvant; P

14、BS, phosphate-buffered saline; i.p., intraperitoneally; s.c., subcutaneously; i.m., intramuscularly; i.v., intravenously; i.d., intradermally.Source: Reproduced from M.A.Kerr and R.Thorpe, Immunochemistry Labfax(1994), Bios Scientific, Oxford.实验(二) 沉淀反应定量法一实验目的：测定抗血清中特异性抗体的浓度。二器材与试剂:137恒温箱2紫外分光光度计3冰箱4塑料离心管（15ml）5抗原（小牛血清）6免疫血清7pH 7.2磷酸缓冲生理盐水（PBS）80.1M NaOH9高速离心机三实验方法在10支塑料离心管里分别加入1，10，20，50，100，150，250，350，450l的抗原溶液，用PBS将每支离心管里的溶液总量加至450l 。然后分别向各支离心管里再加入100l的抗血清