贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍

1、贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第1页Beckman Coulter流式细胞仪发展史1947年Wallace Coulter创造了库尔特原理，用于血细胞分析1953年推出了世界上第一台流式细胞分析仪Coulter Counter Model A1972年推出世界上第一台激光流式细胞仪EPICS II 1975年研制出世界上第一台带计算机流式细胞仪 1997年推出世界上第一台单激光四色数字化流式细胞仪EPICS XL/MCL 年首先将高精度数字化颜色赔偿技术ADC（Advanced Digital Compensation）应用于流式平台，引领流式进入全新全矩阵赔偿、

2、全自动赔偿和脱机赔偿时代年推出世界上第一台单激光五色流式细胞仪FC500/MCL，年升级为FC500/MPL年推出世界上第一台含有EV参数同时进行无成本绝对计数多功效细胞分析系统Quanta SC， 将流式细胞术与库尔特原理完美结合，年推出MPL进样系统年收购Dako企业Moflo和Cyan，使Beckman企业成为高端流式市场领导者年，推出世界是第一台三激光十色分析型流式细胞仪Gallios/Navios贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第2页EPICS XL-ADC QUANTA SCCytomics FC500Beckman Coulter Celllab FamilyMoFlo XDPGa

3、llios/NaviosCyan ADP贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第3页FC500硬件贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第4页What is flow cytometry?流式细胞术是单个细胞/颗粒流过检测装置过程中，检测到物理和/或化学特征。Howard Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3rd Edition贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第5页分类分析型：只能分析用，液流进入废液筒分选型：回收目标细胞，用于后续试验。要求管道绝对无菌。贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第6页 基础原理流路（液流系统）流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*

4、1051*106个/ml光路（光学系统）光源滤片光电倍增管PMT HV电路（电路系统）放大电路HV及GAIN 增益A/D转换分析系统：计算机贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第7页液流系统贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第8页流路结构贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第9页 流 路 单细胞悬液 大多数仪器是在50-300 m 大小孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中 这一过程,成为流体动力学聚焦贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第10页FLOW CELLInjector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第11页光

5、路系统贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第12页光路结构贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第13页光 路光源检测信号 散射光信号FS: 前向角散射光SS: 侧向角散射光(90度散射光) 荧光信号荧光染料光学滤片贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第14页 光 路光源与经过细胞聚焦在同一点上 激光 空冷 488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green,空冷/水冷Enterprise II水冷Innova300系列Innova70系列贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第15页常见激光器及其通道分配表贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第16页检测信号贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍

6、第17页 散射光信号前向散射光(FS)FS-Forward (Angel Light) Scatter在激光束正前方检测器, 为前向散射光检测器 FS强度与细胞或其它颗粒大小, 形状及 optical homogeneity 相关FS用于检测细胞或其它粒子表面属性如:大小 贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第18页FALS SensorLaser前向散射光 贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第19页前向散射光贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第20页 散射光信号 侧向散射光SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器SS用于检测

7、细胞内部结构如:胞浆内颗粒多少, 核质比 贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第21页FALS Sensor90LS SensorLaser侧向散射光贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第22页侧向散射光贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第23页90 Degree Scatter0 200 400 600 8001000815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSide Scatter ProjectionLight Scatter GatingScale贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第24页 光路-荧光信号每种荧光染料都有特定激发波长, 并激发后

8、会有发射波长,流式细胞仪检测即是它特定发射波长. 利用各种不一样波长光学滤片来搜集(检测)这些光学信号贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第25页荧光染料特征激发波长(EXCITING)发射波长(EMISSION)贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第26页常见荧光染料特征荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色FITC 488 525 免疫荧光 绿色PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红PeCy5 488 675 免疫荧光 红PI 488 620 DNA染色 橙红PECy7 488 755 免疫荧光 深红PerCP 488 670APC

9、633 670贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第27页5 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/ECD/PC5/PC7贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第28页荧光染料比较(平均荧光强度) Q-Prep / ImmunoPrep 试剂系统PerCP APC FITC ECD PC5 PECD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APC贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第29页FluorescenceFALS SensorFluorescence detector( FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)贝克曼流式细胞仪原理及软

10、件介绍第30页光路 - 滤片特征 长通滤片 允许长于设定波长光经过 短通滤片 允许短于设定波长光经过 带通滤片 允许一定带宽波长经过贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第31页 光路 - 滤片特征 当以 45o 角放置滤片时,该滤片能够经过一定波长光,同时也能够阻断并折射该波长以下光 这种方式滤片称为二向色性滤片( dichroic filter) 贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第32页滤片带通滤片 BAND PASS (BP)只允许一些波长光经过二向色性滤片 DICHROIC FILTER一定波长以上经过，该波长以下折射630 nm BandPass FilterTransmitted Light

11、White Light Source620 -640 nm LightDichroic Filter/Mirror at 45 degReflected lightTransmitted LightLight Source贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第33页贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第34页电路系统贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第35页Optics - DetectorsPhotomultiplier tube (PMT) 将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号 贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第36页不一样脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)过程 贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第37页贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍第38页Single Parameter Histogram: Count vs MFI贝克曼流式细胞仪原理及软件