时间分辨技术的原理最新资料

1、 PAGE 30时间分辨技术的原理目前最先进的免疫检测技术：时间分辨原理： 用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标记蛋白质、多胎、激素、抗体、核酸探针或生物流行性细胞，当反应体系发生后，用时间分辨仪器测定最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。时间分辨辨原子标标记物的的特点：发射光和和激发光光有较大大的STTOKEES位移移高特特异性长寿命荧荧光，降降低其他他物质的的荧光干干扰高灵敏敏度半衰期长长达几十十万年，试剂受受干扰小小高稳稳定性原原子标记记与大分分子标记记物的对对比 原 子 标标 记 物 大 分分

2、子 标 记记 物标记位点点多个,可可达200个只有1个个对被标记记物蛋白白活性的的影响影响小,基本无无影响影响大,经常影影响蛋白白活性对被标记记物空间间结构的的影响无影响,保证稳稳定性影响大,造成试试剂的不不稳定受环境因因素的影影响影响小影响大,温度影影响33、波长长分辨：标记离子子的荧光光激发光光波长范范围较宽宽，发射射光光谱谱范围较较窄，是是类线光光谱，有有利于降降低本底底荧光强强度，提提高分辨辨率。激发与发发射光之之间有一一个较大大的STTOKEES位移移，有利利于排除除非特异异荧光的的干扰，增强测测量的特特异性。4、时间分分辨：标记离子子螯合物物产生的的荧光强强度高，寿命长长，有利利于

3、消除除样品及及环境中中荧光物物质对检检测结果果的影响响。每一秒名名检测样样品10000次次，取其其中不受受干扰的的4000次的均均值作为为测定值值，有利利于提高高检测的的准确性性。时间分辨辨技术取取代酶免免、放免免是免疫疫检测技技术发展展的必然然趋势！RIA（放免）放射性（1255I），对环境境和身体体的危害害，已经经为重视视环保的的国家逐逐步取消消，如整整个欧洲洲仅尚存存几个放放免试验验室。125II半衰期期短，导导致试剂剂的有效效期短，需每次次定标，造成很很大的浪浪费。由于标记记物（1125II）的不不断变化化，带来来药盒批批间、批批内较大大的变异异，标准准曲线无无法保存存备用。ELEES

4、A（酶免）灵敏度、重复性性不及放放免，易易造成漏漏检和假假阳性。酶的纯度度和反应应过程容容易受环环境因素素影响，导致稳稳定性、重复性性不好。与其它技技术的相相对优势势：（1）、是现有有的免疫疫检测方方法中灵灵敏度最最高的（2）、是现有有的免疫疫检测方方法中稳稳定性最最好的（3）、多标记记检测是是目前所所有免疫疫检测技技术中独独一无二二的TRF技技术与电电化学发发光的比比较时间分辨辨荧光电化学发发光标记物四种原子子:Euu,Smm,Tee,Dyy一种原子子:钌多标记技技术有无科研项目目能(10000多多种科研研项目)无试剂种类类58种临临床,224种科科研,共共82种种40种临临床,无无科研试剂

5、价格格低高TRF与与化学发发光的比比较时间分辨辨荧光化学发光光发光效率率95%1%重复检测测可无数次次重复不可重复复本底噪声声零本底干扰大灵敏级数数10-11910-115标记物原子大分子化化合物标记位点点每个抗体体可达220个1个标准曲线线稳定达一一年以上上稳定2到到4周多标记有,最多多可达四四标记无科研开发发有无时间分分辨荧光光免疫定定量分析析简介时间间分辨荧荧光分析析（Tiimerresoolveed Fluuorooimmmunooasssay,TRFFIA）是一种种非同位位素免疫疫分析技技术，它它用镧系系元素标标记抗原原或抗体体，根据据镧系元元素螯合合物的发发光特点点，用时时间分辨辨

6、技术测测量荧光光，同时时检测波波长和时时间两个个参数进进行信号号分辨，可有效效地排除除非异荧荧光的干干扰，极极大地提提高了分分析灵敏敏度。解离增强强镧元素素荧光免免疫分析析是时间间分辨荧荧光免疫疫分析中中的一种种。它用用具有双双功能基基团结构构的螯合合剂，使使其一端端与铕（Eu）连接，另一端端与抗体体/抗原原分子上上的自由由氨基连连接，形形成EUU标记的的抗体/抗原，经过免免疫反应应之后生生成免疫疫复合物物。由于于这种复复合物在在水中的的荧光强强度非常常弱，因因此加入入一种增增强剂，使Euu3+从从复合物物上解离离下来，自由EEu3+同增强强剂中的的另一种种螯合剂剂螯形成成一种胶胶态分子子团，

7、这这种分子子团在紫紫外光的的激发下下能发出出很强的的荧光，信号增增强了百百万倍。因为这这种分析析方法使使用了解解离增强强步骤，因此称称为解离离增强镧镧系元素素荧光免免疫分析析。乙肝病毒毒（HBBV）标标记物的的检测方方法常用用测定乙乙肝病毒毒的抗原原、抗体体标记物物，由660年代代末700年代初初的琼脂脂扩撒法法，依次次发展为为血凝法法酶联免免疫吸附附（ELLISAA）、同同位素免免疫标记记（RIIA）化学发发光免疫疫分析、生物发发光、电电化学发发光免疫疫标记和和80年年代中建建立的稀稀土离子子荧光标标记（时时间分辨辨荧光免免疫分析析）等不不同的检检测方法法。随着着科学的的发展和和检验技技术的

8、进进步，其其方法每每发展一一步，乙乙肝标记记物检出出的灵敏敏度和准准确性都都得到不不同的提提高。时间分辨辨荧光免免疫分析析（TRRF）为为近年新新研制成成功的用用三价稀稀土离子子作为示示踪物，以单克克隆抗体体包被支支持物与与样品中中抗原反反应，再再加入有有铕（EEU）标标记的抗抗体，进进行反应应检测，可大大大降低一一般同位位素和荧荧光标记记受环境境干扰缺缺点，提提高了检检测的灵灵敏度和和准性，该TRRF法检检测乙肝肝病毒标标记物较较其他方方法灵敏敏度高、特异性性好，干干扰因素素少，TTRF为为目前检检测乙肝肝病毒标标记物最最理想的的方法。TRF定定量检测测乙肝病病毒“两对半半”为临床床诊断乙乙

9、肝提供供了新手手段，有有助于临临床客观观的分析析HBVV感染情情况、疗疗效的观观察和转转归等情情况的分分析，至至少可对对下列情情况更具具有独特特的诊断断价值：1、治疗疗前进行行病毒定定量检测测，可以以指导选选择抗病病毒药物物，避免免盲目用用药。2、治疗疗后定量量间接判判断体内内病毒数数量，有有助于疗疗效的观观察。 3、怀怀孕前进进行定量量测定，有助于于选择有有利于的的怀孕时时机。乙乙肝孕妇妇进行定定量检查查，有助助于使部部分病人人得到及及时的正正确的诊诊断 目前前我科已已正式开开展了乙乙肝二对对半的TTRFIIA定量量分析，其每一一项的正正常值范范围均是是由我国国卫生部部根据美美国雅培培的标准

10、准而制定定，其灵灵敏度，准确度度，及精精确度都都有远远远优于一一般的EELISSA法，乙肝两两对半的的定量制制定将给给临床提提供一个个关于乙乙肝诊断断及疗效效，预后后判断的的更可靠靠的实验验结果。极大地提提高了检检测的灵灵敏度 时间分分辨荧光光免疫定定量技术术（TRRFIAA）检测测HbssAg灵灵敏度可可达0.2ngg/mll,而酶酶标（EEIASSA）检检测的灵灵敏度是是2ngg/mll,极大大地提高高检测的的灵敏度度。因此此，在急急性乙肝肝早期能能及早检检出HbbsAgg，确证证HBVV感染，缩短窗窗口期；其次，可发现现低浓度度HbssAg携携带者；在部分分慢性乙乙肝患者者中，由由于机体

11、体缺乏对对HBVV包蟆蛋蛋白的免免疫应答答，HbbsAgg表达较较低，酶酶标检测测可出现现HbssAg和和HbssAb均均阴性的的情况，TRFF技术则则可避免免这些情情况的发发生，为为正确判判断病情情提供依依据。能动态观观察疗效效和监测测病情定量分析析HBssAg和和HBssAb的的浓度变变化，可可预见急急性乙肝肝是否处处于恢复复期。如如HBssAg浓浓度降低低，HBBsAbb浓度逐逐渐升高高，可说说明病情情正往恢恢复期发发展；反反之，HHBsAAg浓度度处于较较高水平平或上升升趋势，而HBBsAbb一直处处于较低低水平，则易发发展为慢慢性乙肝肝或病毒毒携带者者。定量分析析HBeeAg和和HB

12、eeAb的的浓度变变化，可可反映病病情变化化和治疗疗效果。定量测测定能明明确检测测 HBBeAgg和HBeeAb转转换的时时期，即即表现为为HBeeAg浓浓度下降降和HBBeAbb升高的的过程。高浓度度的HBBeAgg还可间间接提示示病毒处处于高复复制状态态，具有有较高传传染性。高浓度度的HBBeAbb一方面面提示病病情好转转而在某某些时候候（如肝肝功能指指标很差差）则可可能与肝肝坏死、肝硬化化、肝癌癌有关。HBcAAb浓度度的高低低可反映映病毒感感染的状状态。高高浓度的的抗-HHbc提提示乙肝肝性感染染，恢复复期浓度度降低。慢性乙乙肝呈抗抗-Hbbc持续续高浓度度。而低低浓度的的抗-HHbc

13、一一般为恢恢复期或或既往感感染。有利于对对慢性肝肝炎活动动性或非非活动性性的判断断。非活活动性慢慢性乙肝肝各项指指标相对对稳定，活动性性往往呈呈现进行行性变化化。TRFIIA和定定量PCCR技术术可互相相补充血清HBBVDNAA荧光定定量PCCR测定定可以直直接反映映血液中中病毒复复制状态态，具有有很多临临床应用用价值，但不能能完全反反映病毒毒复制静静息期肝细胞胞内HBBV病毒毒状态。HBVVDNAA阴性并并不完全全代表体体内HBBV已被被清除，结合“两对半半”各项指指标更能能客观反反映体内内HBVV病毒状状态。HBsAAb的定定量测定定能够对对乙肝的的预防起起到监督督作用 HBBsAbb的定

14、量量测定能能够对抗抗体是否真正具有有“中和”HBVV的免疫疫力作出出正确评评价，对对乙肝的的预防起起到监督督作用。HBssAb的的含量在在10mmlU/ml以以上病人人ELIISA检检测即可可呈阳性性结果，但并不不提示机机体都一一定具有有免疫力力，而HHBsAAb的含含量在101000mlUU/mll 之间间的样本本，定性性虽为“阳性”，但此此时机体体对HBBV的免免疫力较较弱，甚甚至不能能预防HHBV感感染。只只有HBBsAbb的含量量达到1100mmlU/ml以以上时才才可确定定具有抵抵抗HBBV入侵侵的作用用。作定定量检测测，可根根据HBBsAbb的含量判断机机体对HHBV的的免疫状状态

15、及乙乙肝苗的的免疫效效果。因因此定量量测定对对乙肝疫疫苗免疫疫力的评评价和高高危人群群预防免免疫具有有重要意意义，特特别是在在少年儿儿童预防防乙肝方方面。乙肝两对对半定量量的临床床意义乙肝表面面抗原（HBssAg）定量能极早地地检出HHBsAAg，确确证乙肝肝感染，几乎能能与prreSll同时检检测出。在乙肝肝病程中中大大缩短了了窗口期期的时间间。由于机体体常缺乏乏对包膜膜蛋白的的免疫应应答，HHBsAAg表达达较低，可出现现HBssAg、Antti-HHBs均均阴性的的情况，定量检检测HBBsAgg则可避避免这些些情况的的出现。病毒发生生变异后后，病毒毒表达量量较低，甚至“定性”检测不不出抗

16、原原。可检检测出HHBsAAg，并并极有可可能同时时检测出出HBssAg、Antti-HHBs。国内外学学者研究究表明HHBsAAg的细细胞免疫疫应答与与肝细胞胞损伤有有一定关关系。血血清中HHBsAAg含量量和病人人对HBBsAgg细胞免免疫成反反比关系系，而肝肝功能改改就则与与此种细细胞免疫疫成反比比。而定定量检测测HBssAg是是反映这这一关系系的唯一一手段。一般来说说，慢性性肝炎HHBsAAgCOOI相对对恒定：而活动动性肝炎炎HBssAgCCOI往往往较高高且不稳稳定。2、乙肝肝表面抗抗体（AAntii-HBBs）定定量Antii-HBBs的定定量检测测能够地地机体是是否真正正具有“

17、中和”HBVV免疫力力作为正正确评价价，避免免误误导导病人，对乙肝肝的预防防起到监监督作用用。Antii-HBBs含理理在1001000IU/L之间间的样本本，乙肝肝两对半半定性的的结果为为阳性，但此时时机体对对HBVV并无中中和作用用，仍有有感染HHBV的的危险。只有定定量检测测Antti-HHBs在在1000UI/L以上上时才具具有抵抗抗HBVV入侵的的作用。因此，定量检检测乙肝肝两对半半对乙肝肝疫苗免免疫力的的评价和和高危人人群预防防具有重重要意义义。3、乙能能e抗原原（HBBeAgg）定量量HBeAAg是乙乙肝病毒毒在肝细细胞在繁繁殖时出出现的前前C/CC基因的的产物，经蛋白白酶水解解

18、后HBBe蛋白白质以非非颗粒形形式分泌泌入血清清中。在在急性HHBV感感染时，血清中中可出现现HBeeAg，但维持持可测水水平的时时间很短短暂（数数天数周）。HBBeAgg阳性一一般是提提示有大大量病毒毒存在，是急性性乙肝恢恢复期的的首选血血清学指指标。由前C基基因突变变HBVV感染所所致的急急性或慢慢性乙肝肝，始终终不出HHBeAAg，但但HBVV-DNNA进行行性复制制。HBBeAgg亦在高高COII水平波波动。与与前者HHBeAAg阳性性慢性乙乙肝类型型中的转转换期比比较，两两对半定定性均表表现为小小三阳，但后者者主要表表现在高高HBeeAgCCOI值值，忽高高忽低的的ALTT值和HHB

19、V-DNAA始终阳阳性。4、乙肝肝e抗体体（Annti-HBee定量由HBVV野型株株感染所所引起的的急性或或慢性乙乙型肝炎炎，其自自然史分分为HBBeAgg阳性期期和Annti-HBee阳性期。定量监监测能明明确出HHBeAAg向AAntii-HBBe换的的时期，即表现现为HBBeAggCOII下降（含量降降低）和和Antti-HHBeCCOI下下降（含含量升高高）的过过程。因因此，AAntii-HBBe定量量与HBBeAgg定量联联合检测测对监测测HBVV感染的的病程及及药物的的疗效观观察有很很好的实实际意义义。由前C基基因突就就株HBBV感染染所致异异型慢性性乙肝，由于患患者始终终不出现

20、现HBeeAg。因此，长期监监测患者者Antti-HHBe含含量对判判断其预预后和转转归具有有十分重重要的价价值。5、乙肝肝核心抗抗体（AAntii-HBBc）定定量乙肝病毒毒由外壳壳HBssAg和和内核HHBcAAg组成成。乙肝肝病毒感感染期间间，一般般会产生生Antti-HHBc，在HBBcAgg出现后后即可从从血清中中检测到到。偶尔尔也有AAntii-HBBc阴性性的HBBV感染染者，多多见于免免疫抑制制的病人人。在乙肝感感染康复复者HBBsAgg携带者者中，AAntii-HBBc可长长期存在在。因此此，在特特殊人群群中开展展Antti-HHBc筛筛选试验验对预防防乙肝的的传播有有重要参

21、参考价值值。Antii-HBBc定量量怀其他他HBVV试验一一同检测测有助于于乙肝感感染的诊诊断和监监测。在在其他指指标缺乏乏的情况况下（如如HBssAg阴阴性），Antti-HHBc定定量可能能是现存存HBVV感染的的唯一指指标。时间分分辨免疫疫荧光法法检测乙乙型肝炎炎病毒标标志物临床工作作中发现现少部分分经酶联联免疫吸吸附法（ELIISA）检测仅仅乙型肝肝炎表面面抗原（HBssAg）和抗HBBc IIgG阳阳性的患患者，病病毒含量量却很高高。为此此，采用用时间分分辨免疫疫荧光分分析法（TRFF）对334例此此类患者者进行乙乙型肝炎炎标志物物（HBBVM）的的检查，现将结果果报道如如下：资料

22、与方方法 1.病例选选择：为为20002年22月至99月住院院或门诊诊患者，共344例，男男21例例，女113例，年龄55588岁，平平均（229.2218.7）岁岁。采静静脉血分分离血清清，用EELISSA进行行HBVV标志物物（HBBV MM）检测测及HBBV DDNA定定量检查查。留取取血清置置-300保存。（1）HBssAg、抗HBBc IIgG阳阳性，乙乙型肝炎炎e抗原原（HBBeAgg）、抗抗-HBss、抗-HBcc IggM阴性性；（22）HBBV DDNA含含量1044拷贝/ml;（3）近3个个月未使使用抗病病毒药物物。每人人进行22次抗原原抗体检查查，结果果一致。2次HHBV

23、 DNAA检查，结果相相差1个个数量级级以下。2.常规HHBV M检测测：用EELISSA法，试剂为为上海科科华生物物工程股股份有限限公司产产品，按按产品说说明书操操作。3.HBVV DNNA含理理测定：采用实实时荧光光定量PPCR法法，试剂剂盒购自自广州中中山医科科大学达达安基因因诊断中中心。仪仪器为美美国Peerkiin EElmeer 公公司GeeneAmpp E557000型PCCR仪。严格按按说明书书操作，检测灵灵敏度为为1033拷贝/ml。 4.TTRF法法检查HHBV M：试试剂为上上海新波波生物技技术有限限公司产产品，采采用Annyteest220000时间分分辨检测测仪。严严

24、格按照照说明书书操作。55.统计计分析：取HBBV DDNA含含量的对对数值进进行成组组设计的的两样本本均数比比较，行行t检验验。结果 1.HBVV M ：用TTRF法法检查发发现，334例患患者中HHBsAAg、HHBeAAg、抗抗-HBBc阳性性者155例，HHBsAAg、抗抗-HBee、抗-HBcc均阳性性者144例，仅仅HBssAg、抗-HHBc阳阳性者55例。即即用ELLISAA检查时时HBeeAg假假阴性115例，抗-HBee假阴性性14例例（表11）。 2.HHBV DNAA含量：HBeeAg及及抗-HHBc均均阴性组组、HBBeAgg阳性组组、抗-HBcc阳性组组HBVV DN

25、NA含量量的对数数平均值值分别为为6.4451.774、77.2991.559、55.8001.446。将将前者与与后两组组分别进进行成组组设计的的两样本本均数比比较的tt检验，t值分分别为11.0005、00.8116，PP值均0.005，差差异无显显著性。讨论HBV M的变变化是评评估HBBV感染染后病情情转归的的重要依依据，也也是抗病病毒治疗疗的疗效效考核指指标之一一。通过过TRFF检查发发现，大大部分EELISSA法检检测为HHBsAAg、抗抗-HBBc阳性性模式的的患者其其实为HHBeAAg假阴阴性（115/334，444.112%）及抗-HBee假阴性性（144/344，411.1

26、88%）。仅少部部分可能能为病毒毒变异的的结果。研究发发现，HHBsAAg、抗抗-HBBc浓度度显著高高于正常常，ELLISAA及TRRF符全全率为1100%，抗-HBss浓度明明显低于于正常，两者符符合率为为1000%。而而HBeeAg、抗HBBe浓度度仅稍高高于正常常，因此此ELIISA易易出现假假阴性。目前TTRF主主要用于于激素的的检测。随着仪仪器及试试剂的国国产化，检测费费用的降降低，TTRF因因其突出出的高敏敏感性、特特异性强强、无放放射污染染等特点点，在HHBV M的检检测中有有着广泛泛的应用用前景。作者单位位：41100111长沙沙，中南南大学湘湘雅二医医院肝病病研究中中心目前

27、我我院已正正式开展展了乙肝肝二对半半的时间间分辨定定量分析析，其每每一项的的正常值值范围均均是由我我国卫生生部根据据美国雅雅培的标标准而制制定，其其灵敏度度，准确确度，及及精确度度都有远远远优于于一般的的ELIISA法法，乙肝肝两对半半的定量量制定将将给临床床提供一一个关于于乙肝诊诊断及疗疗效，预预后判断断的更可可靠的实实验结果果。时间分分辨荧光光免疫定定量测定定乙肝两两对半的的临床意意义极大地提提高了检检测的灵灵敏度时间分分辨荧光光免疫定定量技术术（TRRFIAA）检测测HBssAg灵灵敏度可可达0.2ngg/mll,而酶酶标（EEIASSA）检检测的灵灵敏度是是2ngg/ml,极极大地提提

28、高检测测的灵敏敏度。因因此，在在急性乙乙肝早期期能及早早检出HHBsAAg，确确证HBBV感染染，缩短短窗口期期；其次次，可发发现低浓浓度HBBsAgg携带者者；在部部分慢性性乙肝患患者中，由于机机体缺乏乏对HBBV包膜膜蛋白的的免疫应应答，HHBsAAg表达达较低，酶标检检测可出出现HBBsAgg和HBBsAbb均阴性性的情况况，TRRF技术术则可避避免这些些情况的的发生,为正确确判断病病情提供供依据。能动态观观察疗效效和监测测病情 1）定量分分析HBBsAgg和HBBsAbb的浓度度变化，可预见见急性乙乙肝是否否处于恢恢复期。如HBBsAgg浓度降低，HBssAb浓浓度逐渐升升高，可可说明

29、病病情正往往恢复期期发展；反之，HBssAg浓浓度处于于较高水水平或上上升趋势势，而HHBsAAb一直直处于较较低水平平，则易易发展为为慢性乙乙肝或病病毒携带带者。 2）定定量分析析HBeeAg和和HBeeAb的的浓度变变化，可可反映病病情变化化和治疗疗效果。定量测测定能明明确检测测HBeeAg向向HBeeAb转转换的时时期，那那表现为为HBeeAg浓浓度下降降和HBBeAb升升高的过过程。高高浓度的的HBeAg还可可以间接接提示病病毒处于于高复制制状态,具有较较高的传传染性.高浓度度的HBBeAb一方方面提示示病情好好转，而而在某些些时候（如肝功功能指标标很差）则可能能与肝坏坏死、肝肝硬化、

30、肝癌有有关。 3）HHBsAAb浓度度的高低低可反映映病毒感感染的状状态。高高浓度的的抗-HHbc提提示乙肝肝急性感感染，恢恢复期浓浓度降低低。慢性性乙肝呈呈抗-HHbc持持续高浓浓度。而而低浓度度的抗-Hbcc一般为为恢复期期或既往往感染。 4）有有利于对对慢性肝肝炎活动动性或非非活动性性的判断断。非活活动性慢慢性乙肝肝各项指指标相对对稳定，活动性性往往呈呈现进行行性变化化。TRFIIA和定定量PCCR技术术可互相相补充血清HBBVDNAA荧光定定量PCCR测定定可以直直接反映映血液中中病毒复复制状态态，具有有很多临临床应用用价值，但不能能完全反反应病毒毒复制静静息期细细胞内HHBV病病毒状

31、态态。HBBVDNAA阴性并并不完全全代表体体内HBBV已被被清除，结合“两对半半”各项指指标更能能客观反反映体内内HBVV病毒状状态。HBsAAb的定定量测定定能够对对乙肝的的预防起起到监督督作用吗吗？HBsAAb的定定量测定定能够对对抗体是是否真正正具有“中和”HBVV的免疫疫力作出出正确评评价，对对乙肝的的预防起起到监督督作用。HBssAb的的含量在在1000mlUU/mll以上病病人ELLISAA检测即即可呈阳阳性结果果，但并并不提示示机体都都一定具具有免疫疫力，而而HBssAb的的含量在在101000mlUU/mll之间的的样本，定性虽虽为“阳性”，但此此时机体体对HBBV的免免疫力

32、较较弱，甚甚至不能能预防HHBV感感染。只只有HBBsAbb的含量量达到1100mmlU/ml以以上时才才可确定定具有抵抵抗HBBV入侵侵的作用用。作定定量检测测，可根根据HBBsAbb的含量量判断机机体对HBVV的免疫疫状态及及乙肝疫疫苗的免免疫效果果。因此此定量测测定对乙乙肝疫苗苗免疫力力的评价价和高危危人群预预防免疫疫具有重重要意义义，特别别是在少少年儿童童预防乙乙肝方面面。时间分辨辨荧光免免疫分析析在乙肝肝的应用用中南大学学湘雅二二医院肝肝病研究究中心教教授：杨杨旭乙肝抗抗原体测测定是诊诊断乙肝肝最常用用的方法法。酶联联免疫测测定由于于操作简简便，成成本低廉廉，敏感感性和特特异性较较好

33、，880年代代中期以以来就成成为乙肝肝抗原体体检测最最主要的的方法。但是本本法只能能定性，作为定定量测定定的方法法，其重重复性很很差。据据观察，不同乙乙肝感染染者表面面抗原的的浓度相相差8000倍,ee抗原的的浓度相相差1000倍，仅用“阳性”来表示示，实在在太粗糙糙，太不不科学，难以满满足临床床的需要要。观察察指标的的量化是是提高诊诊断水平平的基本本要求，也是科科学发展展的必然然趋势，因此，进入990年代代以来，国外先先后推出出第四代代检测方方法：化化学发光光法、电电化学发发光法。但是这这两个方方法需要要昂贵的的设备，试剂成成本高，难以普普遍应用用。 为了了满足临临床的需需要，根根据国情情和

34、省情情，我科科瞄准抗抗原抗体体检测发发展的方方向，220022年100月引进进具有世世界先进进水平的的时间分分辨荧光光免疫检检测仪，在省内内率先建建交时间间分辨荧荧光免疫疫分析（TRFFIA）检测乙乙肝抗原原抗体的的新方法法，我院院也是国国内少数数应用本本法检测测乙肝的的医院之之一。时时间分辨辨荧光免免疫分析析的原理理和通常常的免疫疫测定方方法基本本相同，只是标标记物和和测定方方法不同同。时间间分辨荧荧光免疫疫分析以以三价稀稀土离子子（常用用的是铕铕）及其其螯合剂剂代替同同位素、荧光素素或酶，作为标标记抗原原或抗体体的示踪踪物，检检测未知知的抗体体或抗原原，用特特制的时时间分辨辨荧光仪仪测定最

35、最后反应应产物中中荧光的的强度，根据荧荧光强度度来判断断待测物物质的浓浓度。在在免疫复复合物中中的稀土土离子自自身可产产生微弱弱的荧光光信号，而当加加入增强强液以后后，稀土土离子从从免疫复复合物中中释放出出来，受受到激发发光照射射时，荧荧光强度度可增强强1000万倍。稀土离离子发出出性荧光光不仅光光度强，而且寿寿命长。反应系系统中许许多物质质也可以以发出荧荧光，但但他们的的荧光的的寿命极极短，因因此，通通过简单单的延时时检测，就可以以将特异异性荧光光与非特特异性荧荧光区别别开来，所以这这个方法法的名称称冠以“时间分分辨”。时间间分辨荧荧光免疫疫分析是是一种超超灵敏的的高度特特异性的的检测技技术

36、，是是今后抗抗原抗体体检测发发展的方方向，其其灵敏度度比化学学发光和和电化发发光高110倍1000倍，比比放免法法和酶标标法高110000倍以上上。据我我科现场场测评，其特异异性、敏敏感性和和重复性性均极强强，几乎乎没有假假阴性，假阳性性率低于于0.11%，同同一标本本连续220次检检测CVV1%，同一一批（110个）连续33天检测测CV= 0.9%，检测后后反应板板连续33天重复复阅读CCV11%。 这一一方法的的建立必将极极大的提提高我科科的乙肝肝诊断水水平，使使我们对对乙肝感感染者的的病情、预后、病毒复复制程度度、抗病病毒药物物的疗效效等的判判断更变变科学。乙肝时时间分辨辨荧光免免疫分析

37、析试剂盒盒共5项项，包括括表面抗抗原、表表面抗体体、e抗抗原、ee抗体和和核心抗抗体，可可任选11项或多多项，全全套需备备血3mml（不不加抗凝凝剂），记账后后（每项项45元元）标本本送传染染科实验验室，当当天下午午出结果果。时间间分辨荧荧光免疫疫测定技技术在HHBVM定量量检测及及临床应应用分析析【摘要】目的 研究乙乙肝病毒毒感染者者血清免免疫学标标志物，利用时时间分辨辨荧光免免疫分析析技术（TRFFIA）检测其其含量结结果与EELISSA法结结果的任任合程度度、灵敏敏度、特特异性；了解TTRFIIA测定定HBVV-M的的准确性性、可行行性及临临床应用用价值。方法 分别用用TRFFIA和和E

38、LIISA法法测定2260例例随机血血清标本本HBVV-M结结果及含含量。结结果HBBsAgg(ELIISA)阳性336例，TRFFIA阳阳性400例，xx2=4,P00.055,两法法符合率率98.46%；抗-HBss(ELLISAA)阳性性1300性，TTRFIIA阳性性1600例，xx2=300，P0.001，两两法符合合率888.5%；HBBeAgg(ELLISAA)阳性性17例例，TRRFIAA阳性118例，x2=1，P00.055，两法法符合率率99.6%；抗-HBee(ELLISAA)阳性性86例例，TRRFIAA阳性773例, x22=6.76，P00.011，两法法符合率率9

39、0.4%；抗-HHBc(ELIISA)阳性554例，TRFFIA阳阳性722例，xx2=155.6 ，P0.001，两两法符合合率911.5%；结论论TRFFIA法法与ELLISAA法比较较，特异异性、敏敏感性都都高，TTRFIIA作用用于HBBV-MM含量检检测可为为临床间间接反映映病毒的的感染状状况，同同时也为为临床疗疗效提供供动力学学观察及及接种乙乙肝疫苗苗提供依依据。关键词词HBVV-M时时间分辨辨荧光免免疫分析析技术 酶联联免疫吸吸附试验验【文献标标识码】A【文文章编号号】16606-81006（220044）066-04486-02Thhe ttimee-reesollvedd f

40、lluorroimmmunnoasssayy TRRFIAA ussed in theeHBBV-MM raatioon ttestt annd tthe anaalyssis on cliiniccal apppliccatiionCCai YihheDeeparrtmeent of Labboraatorry,CChaoozhoouCentrralHosspittal,Guaangddongg52110211.【AAbsttracct】OObjeectiive to stuudy thee suubsttancce oof bbloood iimmuunitty HHBV-M,AAppll

41、yinng,tthetecchnoologgyoof TTRFII-A tto ttestt thhe rresuult andd thhen commparre iitwiith thee reesullt oof tthe ELIISA in fixxnesss,ssenssiviity andd sppeciificcityy annd ttocommpree-hccnd thee acccurracyy,feeasiibillityy annd tthe vallue of cliiniccal apppliccatiionin tesstinng HHBV-M bby TTRFIIA

42、.MMetffodss too deeterr-miinatte tthe ressultt annd cconttentt off2600andd HBBV-MM byy TRRFIAA annd EELISSA rresppecttireely.Ressultts HHBsAAg pposiitree iss36bby EELISSA,aand440byy TRRFIAA, xx2=4,P00.055,thhe ffix ratte iis988.466%;aantii-HBBs pposiitivveiis1330byy ELLISAA,annd1660byy TRRFIAA, xx2=

43、300，P0.001；tthe fixx raate is888.55%；HHBeAAg pposiitivve iis177by ELIISA,andd18bby TTRFIIA, x2=1，P00.055；thhe ffix ratte iis999.6%；Annti-HBee poosittivee iss86bby EELISSA,aand773byy TRRFIAA, xx2=6.76，P00.011，thhe ffix ratte iis900.4%；Annti-HBcc poosittivee iss54bby EELISSA,aand772byy TRRFIAA, xx2=15

44、5.6 ，P0.001，tthe fixx raate is991.55%.CCon-cluusioon TTRFIIA hhas higgherr sppeciificcityy annd ssenssitiivitty tthann ELLISAA,TRRFIAA inn teestiing HBVV-M conntennt mmay inddireectlly nnefllectt thhe vviruus iinfeectiion in cliiniccal andd offferr dyynammicss obbserrvattionn inn thhe cclinnicaal ii

45、ffeectss annd bbasiis iin iinocculaatioon aa-gaainsst HHBV.KKey worrds HBVV-M TRFFIA ELIISA时间间分辨荧荧光免疫疫测定技技术在HHBV-M定量量检测及及临床应应用分析析目目前国内内临床实实验室最最常用的的乙型肝肝炎病毒毒（HBBV）感感染者的的血清学学标志物物检测主主要靠EELISSA法，由于EELISSA法简简单、方方便、快快速的优优点在临临床得到到广泛应应用，但但受方法法学本身身的限制制，它不不能提供供HBVV-M的的具体含含量，只只能作为为阴阳性性判断，故不可可能完成HBVV感染的的动力学学观察，而

46、时间间分辨荧荧光免疫疫技术的的出现提提供了对对HBVV-M进进行定量量检测的的手段。本文采采用TRRFIAA法对2260份份血清标标本进行行HBVV-M检检测，并并与ELLISAA法结果果进行比比较和分分析。现现报告如如下：1对象与与方法1.11对象 血清标标本均来来自本院院门诊及及住院病病人2660例，无年龄龄性别要要求。早早晨空腹腹抽取静脉血血，分离离血清后后产即检检测。1.22检测试试剂ELLISAA试剂盒盒由上海海荣盛生生物技术术有限公公司提供供。TRRFIAA试剂盒盒由广州州市丰华华生物工工程有限限公司提提供。1.33仪器 EL-3122e酶标标仪。泰泰莱-11时间分分辨荧光光分析仪

47、仪。Eggatee23110全自自动洗涤涤。25510变变频振荡荡器。1.44 质控控物 由由卫生部部临床检检验中心心提供。1.55 方法法 ELLISAA法和TTRFIIA法测测定HBBV-MM，严格格按照试试剂操作作规程操操作，同同时加入入相应质质控物监监测。11.6 统计学学方法 采用配配对x2检验。22结果22.1HHBsAAg EELISSA法 结果阳阳性366例，阳阳性率113.88%；TTR-FIAA法结果果阳性440例，阳性率率15.4%；两法都都阳性336例，两法都都阴性2220例例，TRRFIAA阳性而而ELIISA阴阴性4例例，TRRFIAA阴性而而ELIISA阳阳性无，

48、采用配配对x22检验，x2=4,P00.055，差异异有显著著性，两两法比较较符合率率为2556/2260=98.46%；其中中HB-sAgg含量00.55ngg/mll占4例，625nng/mml占77例，22650nng/mml占88例，55150nng/mml占88例，1150nng/mml以上上占133例。2.2抗抗-HBBs EELISSA法 结果阳阳性1330例，阳性率率50%；TRRFIAA法结果果阳性1160例例，阳性性率611.5%；两法法都阳性性1300例，两两法都阴阴性1000例，TRFFIA阳阳性而EELISSA阴性性30例例，TRR-FIAA阴性而而ELIISA阳阳性

49、无，采用配配对x22检验，x2=300,P0.001，差差异有非非常显著著性，两两法比较较符合率率为2330/2260=88.5%；其中-HBss含量1101100mmIU/ml占占79例例，1002000mIUU/mll占166例，220110000mIIU/mml占446例，10000mIIU/mml以上上占199例。22.3HBBeSgg ELLISAA法 结结果阳性性17例例，阳性性率6.5%；TR-FIAA法结果果阳性118例，阳性率率6.99%；两两法都阳阳性177例，两两法都阴阴性2442例，TRFFIA阳阳性而EELISSA阴性性1例，TRFFIA阴阴性而EELISSA阳性性无

50、，采采用配对对x2检验，x2=1,P00.055，差异异无显著著性，两两法比较较符合率率为2559/2260=99.6%；其中HHBeSSg含量量0.0030.11NCUU/mll占1例例，0.110.55NCUU/mll占4例例，0.512NCCU/mml111例，22.18NCUU/mll12例。22.4 抗-HHBe ELIISA法法 结果果阳性886例，阳性率率33%；TRR-FIAA法结果果阳性773例，阳性率率28%；两法法都阳性性67例例，两法法都阴性性1688例，TTRFIIA阳性性而ELLISAA阴性66例，TTRFIIA阴性性而ELLISAA阳性119例，采用配配对x22检

51、验，x2=6.76,P00.011，差异异有非常常显著性性，两法法比较符符合率为为2355/2660=990.44%；其其中抗-HBee含量11.52NCCU/mml144例，22 .115NNCU/ml114例， 5.110NNCU/ml223例，20NNCU/ml以以上244例。22.5抗抗-HBBc EELISSA法结果阳阳性544例，阳阳性率220.88%；TTRFIIA法结结果阳性性72例例，阳性性率277.7%；两法法都阳性性52例例，两法法都阴性性1866例，TTRFIIA阳性性而ELLISAA阴性220例，TRFFIA阴阴性而EELISSA阳性性2例，采用配配对x22检验，x2

52、=155.6,P00.011，差异异有非常常显著性性，两法法比较符符合率为为2388/2660=991.55%；其其中抗-HBcc含量00.10.55NCUU/mll11例例，0.511NCUU/mll1例， 15NCUU/mll10例，5.110NNCU/ml336例，10NNCU/ml以以上14例。33讨论TTRFIIA法检检测HBBV-MM与ELLISAA法相比比，其特特异性和和敏感性性都高，特别是是能够检检测低浓浓度HBBsAgg和HBBeAgg，对减减少HBBV感染染漏诊和和误诊具具有较高高价值。因HBBsAgg阳性是是HBVV感染的的金标准准1。有学学者对血血清呈低低水平存存在、血

53、血清HBBsAgg约在55ng/ml以以下者做做过研究究2，对象象是非肝肝炎患者者住院人人群，结结果是占占总人群群的2.34%，占HHBsAAg阳性性人群的的23.16%。而本本文只检检测出11.5%和100%。此此结果存存在一定定差异，有待进进一步探探讨。抗抗-HBBs是对对HBVV的保护护性免疫疫指标，有学者者认为仍仍有保护护作用的的最低抗抗-HBBs的浓浓度为110mIIU/mml，提提出基础础免疫后后高度抗抗体滴度度的再接接种方案案，最后后一次接接种后44周，如如抗-HHBs10mmIU/ml立立即再接接种；1101000mIUU/mll，36个月月后必须须再接种种3。实际际工作中中发

54、现抗抗-HBBs定量量检测对对于监测测、指导导肝移值值中乙型型肝炎免免疫球蛋蛋白的应应用具有有肯定作作用。说说明了对对抗-HHBs定定量的检检测是很很有必要要的，同同时也可可了解人人体是否否有抗-HBss、是否否有足够够的量可可抵御HHBV的的侵袭。本文抗抗-HBBs结果果显示，1600例TRRFIAA法阳性性79例例，抗-HBss浓度值值在1001000mIUU/mll以内，此量因因无确切切的抵御御能力，建议加加强预防防措施。对于抗抗-HBBs阴性性的人群群更应做做好预防防，至于于1000mIUU/mll以上含含量的人人群，说说明他们们已有好好的抵御御能力。另外结结果提示示，ELLISAA法

55、的抗抗-HBBe阳性性率明显显高于TTRFIIA法，由于本本身方法法学的限限制，最最好在发发出报告告时加以以综合分分析或提提高Cuutofff值。从实验结结果表明明HBVV-M各各项阳性性结果都都显示了了不同的的含量，说明了了人体感感染HBBV后，病毒的的复制程程度或经经抗病毒毒药物治治疗后，HBVV-M含含量也随随之变化化，提示示了动力力学关系系。据所所掌握的的资料观观察，患患都治疗疗前及治治疗后HHBV-M含量量变化结结果比较较。见表表1。表1 22例病人人HBVV-M治治疗前后后结果比比较 略可以看出出，HBBsAgg和HBBeAgg逐渐下下降，而而所有抗抗体逐步步增高，这说明明抗病毒毒

56、治疗是是有效的的，同时时也给临临床预后后判断提提供了依依据。目前临床床上对检检测HBBV-MM的血清清常用方方法是血血清免疫疫学检测测，也就就是检测测患者对对病毒侵侵染机体体产生的的免疫反反应，因因此免疫疫血清学学指标可可间接反反映病毒毒的感染染状况。随着检检测水平平的不断断提高，TRFFIA技技术的问问世给免免疫自身身的研究究和发展展提供了了新的手段段。虽然然DNAA是直接接反映病病毒本身身在机体体内的存存在情况况，而人人们越来来越意识识到两者者既相关关，又不不尽一致致，高灵灵敏准确确的HBBV-MM定量结结果可与与HBVV-DNNA的检检测相互互印证，给临床床提供更更客观有有效的实实验报告

57、告，临床床上需要要将两者者结合起起来对患患者进行行综合诊诊断、治治疗和预预后等判判断。如如果在没没有开展展HBVV-DNNA项目目检测的的单位，HBVV-M含含量检测测其本身身也就是是一个很很好监测测病毒动动力学变变化的辅辅助指标标。参考考文献陈紫榕，病毒性性肝炎，北京：人民卫卫生出版版社，220022，6，1911.陈瑜，钟钟步云，徐根云云，等.低水平平血清乙乙肝病毒毒表面抗抗原测定定及临床床意义。中华检检测医学学杂志，20001，224：11.Klauus-ppeteer MMaieer 著著，郝连连杰等译译.第四四版；北北京人民民卫生出出版社，19997，88，355。作者单位位：522

58、10221广东东省潮州州市中心心医院检检验科关于乙肝肝病毒标标记物“两对半半”定量测定和肝肝功能（肝纤维维化）检检测的通通知各临床科科室： 为增增加我院院临床诊诊断、治治疗和观观察病情情的参考考依据，进一步步提高我我院的医医疗水平平和我院院的综合合竞争能能力。我我们要积积极开展展应用技技术、新新项目。最近检检验科在在院领导导的大力力支持下下引进了了WALLLACC公司生生产的时时间分辨辨荧光免免疫分析析系统，该时间间分辨荧荧光免疫疫分析系系统可进进行多种种检测（见附录录）其中中对“乙肝两两对半”可进行行准确的的定量测测定。欢欢迎各临临床科选选用医务科科20002年112月225日一、两对对半定

59、量量测定乙肝病毒毒（HBBV）标标记物的的检测方方法常用用测定乙乙肝病毒毒的抗原原、抗体体标记物物，由660年代代末700年代初初的琼脂脂扩撒法法，依次次发展为为血凝法法酶联免免疫吸附附（ELLISAA）、同同位素免免疫标记记（RIIA）化学发发光免疫疫分析、生物发发光、电电化学发发光免疫疫标记和和80年年代中建建立的稀土土离子荧荧光标记记（时间间分辨荧荧光免疫疫分析）等不同同的检测测方法。随着科科学的发发展和检检验技术术的进步步，其方方法每发发展一步步，乙肝肝标记物物检出的的灵敏度度和准确确性都得得到不同同的提高高（其中中RIAA为100-122moll/L、ECLL 100为100-199

60、 mool/LL、CLLIA为为10-15mm oll/L、ECLL10为为-177/L、TRFF为100-199 mool/LL）。其其中时间间分辨荧荧光免疫疫分析（TRFF）为近近年新研研制成功功的用三三价稀土土离子作作为示踪踪物，以以单克降降抗体包包被支持持物与样样品中抗抗原反应应，再加加入有铕铕（EUU）标记记的抗体体，进行行反应检检测，可可大大降降低一般般同位素素和荧光光标记受受环境干干扰缺点点，提高高了检测测的灵敏敏和准性性，该TTRF法法检测乙乙肝病毒毒标记物物较其他他方法灵灵敏度高高、特异异性好，因干扰扰因素少少可大地地优于以以上各种种方法，可与HHBV-DNAA的检测测相比（