高通量测序技术临床应用质量管理

1、高通量测序技术临床应用质量管理李金明 国家卫生计生委临床检验中心第1页基因测序技术发展1953年：DNA双股螺旋发觉（英国剑桥大学James Watson 和Francis Crick ）1965年：酵母tRNA测序（美国Comell大学Rober Holley，小片段重合法）1971年：噬菌体两个粘性末端完整序列（吴瑞博士，华裔分子生物学教授，引物延伸测序）1975年：加减法 DNA测序（英国剑桥大学Fred ）1977年：Sanger测序（英国剑桥大学Fred Sanger）和Maxam-Gillbert DNA化学降解法测序(美国哈佛Alan Maxam &Walter Gilbert）

2、1996年：焦磷酸测序（瑞典皇家技术研究所Ronaghi M等）:Genome Sequencer20新一代测序仪(大规模并行焦磷酸合成测序法，454 life Science企业创始人Jonathan Rothberg)年:454、Solexa企业和Agencourt（SoliD测序仪）企业分别被Roche、illumina和ABI企业收购。新一代测序技术（next-generation sequencing）年被Nature Methods评为生物领域影响力最大技术第2页精准医学不等于高通量测序高通量测序是精准医学支点第3页高通量测序技术临床应用染色体非整倍体无创产前筛查（NIPT）胚胎植

3、入前遗传学筛查（ Preimplantation Genetic Screening，PGS）和胚胎植入前基因诊疗（Preimplantation Genetic Dignosis，PGD）肿瘤靶向治疗基因突变检测单基因遗传病检测病原微生物检测：如HPV基因分型、宏基因组（Metagenomics）测序第4页高通量测序技术临床应用规范化和质量管理国家卫生计生委医政医管局高通量测序临床应用试点试验室：评审标准、评审、试点试验室基本要求、管理试点试验室增加质评调查：全国肿瘤诊疗与治疗高通量测序检测 年新增质评计划：染色体非整倍体（21、13、18）无创产筛年即将增加质评调查：肿瘤游离DNA（ctD

4、NA）检测第5页第6页同意第一批四个专业试点单位第7页第8页国家卫生计生委高通量测序试点试验室要求第9页基本要求（1）1. 试点试验室应在国家卫生计生委同意试点专业范围内开展临床检测工作。2. 试点试验室需采取高通量测序开展不少于一项检测项目。3. 为防止污染所致假阳性结果，各试点试验室应依据所开展检测项目进行分区，详细各专业试验室分区要求由国家卫生计生委临床检验中心负责公布。第10页产前筛查与产前诊疗（全基因组低拷贝测序技术）缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向文库扩增与检测区标本与文库制备区试剂准备区标本与文库制备区文库扩增与检测区测序区第11页植

5、入前胚胎遗传学诊疗(全基因组低拷贝测序)缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库检测区WGA制备区试剂准备区缓冲间缓冲间空气流向空气流向电泳区扩增一区第12页遗传病诊疗+肿瘤诊疗与治疗（杂交捕捉测序技术+Sanger测序验证）DNA打断区缓冲间缓冲间杂交捕捉区（扩增一区）空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库扩增区（扩增二区）标本与文库制备区试剂准备区文库检测区测序区电泳区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间杂交捕捉区（扩增一区）空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库扩增区（扩增二区）标本与文

6、库制备区试剂准备区文库检测区测序区电泳区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间第13页关于“分区”、缓冲间和生物安全柜“各区独立注意风向因地制宜方便工作”试验室应依据自己检验项目、所采取检测技术平台和工作量来决定分区多少及各区域空间大小。最少详细需要多少个区，一样是“个体化”，以“工作有序、互不干扰、预防污染、汇报及时“作为基本标准。缓冲间功效是“控制空气流向”。生物安全柜可考虑“A2”。缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向文库扩增与检测区标本与文库制备区试剂准备区第14页高通量测序试验室设计需注意几点电泳区：DNA提取、DNA片段化后大小

7、判定等步骤需要用到电泳，单独成区，但不一样检测项目能够共用该区域。测序区：应为恒温恒湿试验室，2小时温度波动应小于2。分区设置可依据自动化仪器设备引入做适当流程、区间整合。无创产前筛查试验室，因血浆提取为胎儿微量DNA，为预防污染，不能与其它项目标标本制备区共用。其它：试验室通风换气（10次/小时）、生物安全柜等要求普通基因扩增试验室。第15页基本要求（2）4. 试点试验室如使用商品化试剂，则应该使用经过国家食品药品监督管理总局（CFDA）同意试剂，临床应用前应经过性能验证；如使用自配试剂（LDT），必须建立自配试剂标准操作程序，并经过性能评价。以上均须保留对应试验统计。5. 试点试验室应对对

8、应检测仪器设备进行日常维护和定时校准，并保留仪器维护校准统计。第16页“性能验证”（“verification”）定义“verification”： broadly as “confirmation through the provision of objective evidence, that specified requirements have been fulfilled” . （广义为经过提供客观证据证实特定要求得到满足）CLIA uses the term “verification”： specifically to relate to confirmation that th

9、e laboratory using a test can replicate the manufacturers performance claims when the test is used according to the package insert. （CLIA性能验证术语特指使用某特定检测试剂或系统试验室按照所提供试剂盒或检测系统说明书使用时，能复现生产厂家所宣称检测性能。）第17页“性能确认”（“validation” ）定义The FDA and ISO both define the term “validation” as “confirmation by examina

10、tion and provision of objective evidence that the particular requirements for a specific intended use can be consistently fulfilled” . （经过检验和提供客观证据证实，对一特定预期应用要求一直能得到满足）The FDA and ISO terms for verification and are similar, with the distinction having to do with intended use. （性能验证和性能确认FDA和ISO术语相同，差

11、异在后者“预期用途”）第18页“intended use”预期用途 The term “intended use” in these documents is established by the manufacturer or developing laboratory at the time of assay development and has to do with the purpose and population for which the test was intended (e.g., diagnosis, following treatment, etc.). Releva

12、nt performance characteristics are then determined based on the intended use of the test. Some people interpret “intended use” as referring to the relevant clinical laboratory in which the test is performed, rather than the manufacturer or developing laboratory, thus causing confusion. The World Hea

13、lth Organization (WHO) defines validation as “the action (or process) of proving that a procedure, process, system equipment or method used works as expected and achieves the intended result” . （WHO将validation定义为，证实所使用一个程序、过程、系统设备或方法能按预期进行工作以及取得预期结果活动（或过程）第19页“validation” 通俗一点定义the term “validation”

14、 will be used to refer to the analytic performance characteristics that need to be initially established at the time of assay development. （指在测定方法研发时，最早建立分析性能特征）第20页NGS性能评价指标有哪些？精密度（precision）：重复性研究准确度（accuracy）：方法学比较研究分析灵敏度（analytical sensitivity）：测定下限研究分析特异性（analytical specificity）：干扰物质研究可汇报范围（ re

15、portable range)：可测定基因区域研究第21页基本要求（3）6. 试点试验室应对技术人员制订培训计划，进行相关在岗连续培训，保留人员培训统计。7. 试点试验室应建立日常检测试验统计方式，并保留对应统计。8,试点试验室应建立规范检测结果汇报与解释模式。第22页第23页第24页第25页第26页第27页第28页第29页第30页第31页第32页第33页基本要求（4）9. 试点试验室 应建立室内质量控制程序，在日常检测中开展室内质量控制，保留室内质控及其失控及定时综合分析统计，并有质量改进办法。10. 试点试验室应参加由国家卫生计生委组织对应项目标室间质量评价或进行有效试验室室间比对，并保留

16、室间质量评价或试验室室间比对统计，对不合格结果应进行原因分析，并采取质量改进办法。第34页室内质量控制（Internal quality control, IQC）采用已知阴性和弱阳性质控品进行室内质控是保证检测质量关键环节，其监控是实验室测定最重要性能指标即重复性，并决定了当批实验测定是否有效，报告能否发出，是对实验室测定即时性评价。是质量改进不可缺少措施。阴性质控品：不是指突变阴性样本，而是采用无模板对照（No Template Control, NTC）作为阴性质控品，阴性质控品需包含在所有扩增步骤中，以证实在样本和试剂中没有核酸污染。阳性质控品：包括至少一个已知突变位点，最好变异百分比

17、接近检测下限，以证实低百分比突变可在每批次中检出。质控样本无需在每批检测中包括所有突变类型，只需加入一个已知突变位点质控品。但是，实验室最好有多个突变质控品，并在日常检测中轮流使用。质控样本可以采用人基因组DNA或其他合成带有突变基因组DNA（不建议采用质粒）。但是这种质控品不能监测提取过程。临床样本当然是最理想质控品，但是样原来源有限，很难长期使用。第35页室间质量评价（External quality assessment, EQA）EQA或试验室间比正确目标：监测试验室测定准确性或结果可比性；是质量改进不可缺乏办法。EQA样本：肿瘤靶向治疗包括基因位点较多，EQA往往难以覆盖全部情况，而

18、且为确保EQA样本起源和重复性，EQA组织者可能采取细胞系或人基因组DNA作为评价样本临床试验室可经过临床样本试验室间比对，来作为补充。第36页基本要求（5）11. 试点试验室应制订包含以下内容标准操作程序（SOP）及相关统计表格： （1）样本采集、运输、保留、接收、登记和处理； （2）知情同意通知； （3）检测方法和步骤； （4）试剂和耗材选择和保留（如为自配试剂，需详细写明试剂制备过程以及各原料起源）； （5）试剂性能验证或自配试剂性能评价和方法确认； （6）仪器使用、维护和校准； （7）人员培训； （8）结果汇报与解释； （9）试验室数据、相关文件统计与保留； （10）室内质量控制； （

19、11）室间质量评价或试验室间比对； （12）知情同意和保密程序。12. 其它未尽事项要求，试点试验室均应参考医疗机构临床基因扩增检验试验室管理方法。第37页试验室质量管理“灵魂”源于一些标准文件（如仪器试剂说明书、国际国内标准文件）和试验室实际工作经验积累。所以高于相关标准文件！SOP等于试剂盒说明书吗？标准操作程序（SOP）是试验室“最高标准”！有可操作性SOP是质量管理“灵魂”！第38页试点试验室可参考一些指南性文件第39页个体化医学检测管理方法及相关指南和导则制订分工指南名称责任人药品代谢与效应基因多态性检测相关技术指南 周宏灏院士肿瘤相关个体化医学检测技术指南詹启敏院士曾益新院士遗传病

20、相关个体化医学检测技术指南曾溢滔院士病原微生物相关个体化医学检测技术指南尚 红教授芯片技术个体化医学检测应用技术指南程 京院士测序技术个体化医学检测应用技术指南于 军教授原位杂交技术个体化医学检测应用技术指南陈 杰教授个体化医学检测LDT相关技术指南程 京院士个体化医学检测试验室管理方法尚 红教授李金明教授 第40页美国CLSI制订一些与分子检测相关导则或指南项目名 称内 容1CLSI/NCCLS MM1A基因疾病分子诊疗方法2CLSI/NCCLS MM2-A2免疫球蛋白和T细胞基因重排检测3CLSI/NCCLS MM3-P2传染性疾病分子诊疗方法4CLSI/NCCLS MM5-A分子血液病理

21、学核酸扩增检测5CLSI/NCCLS MM6传染性疾病定量分子检测方法6CLSI/NCCLS MM7-A医学遗传检测中荧光原位杂交方法7CLSI/NCCLS MM9-A试验室诊疗医学中核酸测序方法8CLSI/NCCLS MM10-P传染性疾病基因分型9CLSI/NCCLS MM12-P诊疗用核酸芯片10CLSI/NCCLS MM13-A分子诊疗方法中标本搜集、运输、处理和储存11CLSI/NCCLS MM14-A分子诊疗方法中能力验证12 CLSI/NCCLS MM14-A2分子检测能力验/室间质量评价设计13CLSI/NCCLS MM16-P外源RNA对照用于基因表示检测14 CLSI/NC

22、CLS MM20-A分子遗传检测质量管理 第41页高通量测序室间质量评价染色体非整倍体（T21、T18和T13）无创产前筛查肿瘤基因突变高通量测序检测第42页全国外周血胎儿染色体非整倍体（T21、T18和T13）高通量测序检测室间质量评价调查活动样本信息样本编号预期结果样本性质胎儿游离DNA浓度是否计分21号染色体非整倍体18号染色体非整倍体13号染色体非整倍体1401阴性阴性阴性染色体正常阴性样本是1402阳性阴性阴性T21610%是1403阴性阳性阴性T184%否1404阴性阴性阴性性染色体异常XXX是1405阴性阴性阳性T13610%是1406阴性阳性阴性T1810%, 70%嵌合是14

23、07阴性阴性阴性染色体正常阴性样本是1408阴性阳性阴性T18610%是1409阴性阴性阴性染色体正常阴性样本是1410阳性阴性阴性T2110%, 30%嵌合否1411阴性阳性阴性T1810%, 30%嵌合否1412阴性阴性阴性染色体正常阴性样本是1413阴性阴性阳性T1346%是1414阳性阴性阴性T2146%是1415阳性阴性阴性T2110%, 70%嵌合是1416阴性阴性阴性染色体正常阴性样本是1417阴性阴性阳性T134%否1418阴性阳性阴性T1846%是1419阳性阴性阴性T215M3.2M41.9646M2M41.9640.200ng/lNA3.0M3.112.393.113.5

24、M1.8M3NA3233.52.53.53pM5M3M31.9632 ng/l 10 M4M3.52.83.51 nmol/LNA3M3230.20ng/lNA3M3233NA4245ng/ul6M5M3.52.5-3.510%EGFRNM_005228.3(EGFR):c.493CT(p.Arg165Trp)450%FGFR3NM_000142.4(FGFR3):c.1948AC(p.Lys650Gln)1450%IDH1NM_005896.2(IDH1):c.395GA(p.Arg132His)450%RETKIF5BENST00000302418:r.1_2183_RETNM_02097

25、5:r.2327_5629E15:E1220%1502FGFR2NM_000141.4(FGFR2):c.1124AG(p.Tyr375Cys)950%PTPN11NM_002834.3(PTPN11):c.182AG(p.Asp61Gly)320%ROS1SDC4ENST00000372733:r.1_239_ROS1NM_002944:r.5448_7368E2:E3210%TP53NM_000546.5(TP53):c.448_459del12(p.Thr150_Pro153del)550%1503BRAFNM_004333.4(BRAF):c.1799TA(p.Val600Glu)15

26、20%EGFRNM_005228.3(EGFR):c.2573TG(p.Leu858Arg)2150%FLT3NM_004119.2(FLT3):c.2520_2521insGGATCC(p.Ser840_Asn841insGlySer)2050%KRASNM_033360.3 (KRAS):c.34GC(p.Gly12Arg)210%1504ALKEML4ENST00000318522:r.1_1751_ALKENST00000389048:r.4080_6220E13:E2020%EGFRNM_005228.3(EGFR):c.2237_2254del18(p.Glu746_Ser752d

27、elinsAla)1950%ERBB2NM_004448.2(ERBB2):c.2263_2264TTCC(p.Leu755Pro)1950%NOTCH1NM_017617.3(NOTCH1):c.5965GA(p.Asp1989Asn)3250%NRASNM_002524.4(NRAS):c.35GA(p.Gly12Asp)220%PDGFRANM_006206.4(PDGFRA):c.1664AG(p.Tyr555Cys)1250%1505AKT1NM_001014432.1(AKT1):c.49GA(p.Glu17Lys)250%PDGFRANM_006206.4(PDGFRA):c.1681_1682insAGAGGG(p.Arg560_Val561insGluArg)1220%KRASNM_004985.3(KRAS):c.34GT(p.Gly12Cys)21%1506EGFRNM_005228.3(EGFR):c.2156GC(p.Gly719Ala)1850%JAK2NM_004972.3(JAK2):c.1821GC(p.lys607Asn)1450%NRASNM_002524.4(NRAS):c.38GA(p.Gly13Asp)250%GNASNM_000516.4(GNAS):c.601CA(p.Arg201