高通量测序在临床精准诊断中的应用

1、高通量测序（NGS）在临床精准诊疗中应用第1页高通量测序成本快速下降第一次人类基因组测序耗时，成本30亿美元，到11月，基因组测序仅需一两周，花费10万美元。新一代仪器可将全基因组序列测序成本降到1000美元以下，成本不足第一代百万分之一。而且伴随技术进步，仍在不停下降。成本快速下降，测序领域超摩尔定律助推临床应用第2页测序设备发展现实状况3第一代（稳定需求）ABi3130 xL(FDA CFDA)3730 xL3500 xL（FDA CFDA）第三代Life Technologies (ABi)Ion Torrent PGMHelicos BiosciencesHelicos Genetic

2、 Analysis System Pacific BiosciencesRSSystem 第二代（高速发展）RocheGenome Sequencer FLX System GS Junior System IlluminaGenome Analyzer IIxMiSeqHiSeq 1000HiSeq HiSeq 2500Life Technologies (ABi)5500 SOLiD System5500 xL SOLiD SystemDanaherMotionPolonator G.007Complete Genomics无锡艾吉因生物信息技术有限企业AG-100深圳华因康基因科技有限企

3、业（CFDA）Pstar-1中科院北京基因组所/半导体所BIGIS-1BIGIS-4第3页各类高通量测序技术原理第4页高通量测序技术在临床中主要应用范围出生缺点相关分子诊疗中应用无创产前检测领域中应用（NIPT）染色体畸变检测领域中应用（CNV-seq）胚胎植入前遗传学筛查领域中应用（PGS）肿瘤相关分子诊疗中应用遗传性肿瘤突变检测（Germ line）肿瘤组织体细胞突变检测（Somatic）液态活检（Liquid Biopsy）第5页出生缺点防治，任重而道远。“ 据预计，当前我国出生缺点发生率在5.6%左右,每年新增出生缺点数约90万例。出生缺点不但影响儿童生命健康和生活质量，而且影响整个国

4、家人口素质和人力资源健康存量，影响经济社会健康可连续发展。” 中国出生缺点防治汇报（）第6页新生儿万出生缺点婴儿100万6染色体疾病10单基因疾病 3040多基因疾病11智力障碍2030各种畸形染色体核型发病率唐氏综合征47，+211/700爱德华氏综合征47，+181/3000帕陶氏综合征47，+131/10000特纳综合征45，XO1/3000活产女婴克氏综合症47，XXY1/1000活产男婴出生缺点分为染色体疾病、单基因和多基因疾病第7页NGS在无创产前检测领域中应用（NIPT）第8页NIPT科学基础 血浆游离胎盘DNA胎儿游离DNA：cell-free fetal DNA（cffDNA

5、）Lancet.1997胎盘起源母体外周血含有cffDNA，几乎全部起源于胎盘滋养层细胞。检出时限怀孕4周可检出，8周后含量上升并稳定存在。12第9页无创取样 - 抽血孕周范围广 12周到26周质控轻易 不依赖孕妇年纪孕周等原因、轻易建立标准试验规范不受上一胎影响NIPT相较临床常见产前检测技术优势检测技术 检测孕周描述血清学筛查（唐氏筛查） 10-12周； 16周左右5%假阳性率；20%-40%漏诊率绒毛膜取样 10-13+6周侵入性；有一定流产风险羊水穿刺 16-20+6周侵入性；有一定流产风险脐静脉血穿刺 20-28周侵入性 ；有一定流产风险无创DNA产前检测（NIPT） 12-26周非

6、侵入性，安全；准确率99%以上第10页多国出台NIPT指南国际专业协会发表NIPT指导意见美国妇产科医师学会（ ACOG）和美国母胎医学会（SMFM）美国遗传学咨询协会（NSGC）国际妇产科超声协会（ISUOG）国际产前诊疗协会（ISPD）加拿大妇产科医师协会（SOGC）美国医学遗传学及基因组学学院（ACMG）意大利母胎医学协会 美国都是CLIA（Clinical Laboratory Improvement Amendments）认证机制，无FDA同意企业 ACAOG 0626第11页.1.15 卫计委妇幼司我国NIPT临床应用政策法规目标：完善技术规范明确在孕产妇人群中适用范围界定其在整体

7、产前筛查与诊疗服务体系中合理定位规范服务流程提升服务质量和管理水平高通量基因测序产前筛查与诊疗技术规范（试行）第12页NIPT临床质量控制21三体综合征99%18三体综合征97%13三体综合征90%检出率复合假阳性率不高于0.5%假阳性率复合阳性预测值不低于50%阳性预测值复合假阴性率约为0.3%假阴性率胎盘/胎儿染色体结构差异（也叫不足胎盘嵌合，cpm）现象是因为发育造成，机制主要是受精卵发育早期染色体纠正，在正常孕妇群体里发生率约千分之1-5，是nipt假阳性发生主要原因。这种现象在生殖领域（pgs）也存在，详细指囊胚活检样本与其内细胞团染色体结构不一致，发生百分比要比孕期cpm高，大约1

8、-10%，因为研究难度较大，详细数字还没有共识。第13页NIPT未来发展空间大测序深度染色体非整倍体 唐氏综合征、爱德华氏综合征、等染色体微缺失微重复综合征 Digeorge综合征、猫叫综合征、等单基因病 耳聋、地中海贫血、苯丙酮尿症、等AAGCTTGCGACTTCAGTTAGCGCTAAGCCAGTGCATG第14页NGS在染色体畸变检测领域中应用（CNV-seq）第15页染色体疾病结构异常缺失、重复非平衡易位环状、等臂等数目异常多倍体非整倍体CNV-Seq应用领域流产原因查找产前（羊水、脐血）检测 不孕不育原因查找染色体疾病先证者染色体异常检测第16页CNV-Seq技术操作流程第17页CN

9、V-Seq针对人群产前诊疗：含有染色体疾病家族病史夫妇死胎、重复性流产，需要查明原因夫妇曾经生育有出生缺点患儿孕妇染色体核型分析结果为正常，但超声显示结构异常胎儿及其父母胎儿宫内发育迟缓先证者遗传病诊疗：染色体核型分析正常，但临床表现为发育迟缓、智力低下、自闭、各种畸形、生育障碍等患者及其父母其它医学检测为染色体疾病，需要确诊患者第18页NGS在胚胎植入前遗传学筛查中应用（PGS)第19页PGS临床流程第20页检测内容：全部染色体非整倍体大于4Mb新发染色体微缺失/微重复大于1Mb遗传自父母染色体微缺失/微重复使用范围:高龄患者（35岁）有重复流产史患者（自然流产3次）重复胚胎种植失败患者（失

10、败3次）生育过染色体异常患儿夫妇本身染色体数目或结构异常夫妇严重男性不育（SMF），少弱精子症、畸精症自愿接收胚胎染色体异常排查夫妇PGS检测内容及适用范围第21页对NGS在PGS应用思索高灵敏NGS技术测序环境防污染系统建立 单细胞测序 操作者脱落细胞污染？样本与植入物一致性问题 胎盘/胎儿染色体结构差异（也叫不足胎盘嵌合，cpm）现象在生殖领域（PGS）也存在，详细指囊胚活检样本与其内细胞团染色体结构不一致，发生百分比大约1-10%，因为研究难度较大，详细数字还没有共识。注册审批难度 1)国家标准物质研制 2)临床试验难点?第22页NGS在肿瘤分子诊疗中应用*每10万人发病人数 *每10万

11、人死亡人数数据起源：全国肿瘤登记中心中国肿瘤登记年报前十大肿瘤发病占肿瘤整体发病百分比76.39%前十大肿瘤死亡占肿瘤整体发病百分比84.27%发病率*每年新发3,120,000人死亡率*每年死亡2,700,000人肺癌，54人胃癌，36人结直肠癌，29人肝癌，29人食管癌，22人乳腺癌，21人胰腺癌，7人淋巴癌，7人膀胱癌，7人甲状腺癌，7人肺癌，46人肝癌，26人胃癌，26人食管癌，17人结直肠癌，14人胰腺癌，7人乳腺癌，5人白血病，4人脑癌，4人淋巴癌，4人第23页各种临床肿瘤分子诊疗需求全方面基因检测各种样本类型可进行疗效监测靶向用药相关基因化疗用药相关基因肿瘤易感性相关基因检测肿瘤

12、发生相关基因检测血液样本小标本组织样本大标本组织样本准确定量第24页遗传性肿瘤突变检测（Germ line）临床应用：检测各种肿瘤患病风险；检测肿瘤基因型，判定家系组员患病风险；指导肿瘤个性化治疗。科研应用快速、低成本探索肿瘤相关基因突变；若采取毛细管测序技术，一次只能检测一条DNA片段，需要大量人力，成本高，且需要大量DNA样本。、茱莉 BRCA1阳性针对肿瘤基因外显子或SNP多态性位点进行NGS检测。第25页肿瘤组织体细胞突变检测（Somatic）肺癌Lung结肠癌Colon黑色素瘤Melanoma胃癌Gastric卵巢癌OvarianEGFRKRASKRASBRAFBRAFKITKITP

13、DGFRAAKT1PIK3CAAKT1PIK3CAGNAQKRASAKT1FGFR2AKT1ERBB2ALKPTENAPCPTENMAP2K1NRASPIK3CAp53PTENp53BRAFp53CTNNB1SRCPIK3CAPTENCTNNB1MAP2K1EGFRp53METNRASFBXW7METNRASIndustry GuidelinesEmerging and Clinical Trials 指导肿瘤个体化治疗第26页很多肿瘤患者无法进行活检或手术；穿刺受检者严重不适感；穿刺本身临床风险；取材时间点受限，极难进行屡次取样；肿瘤异质性。基于组织肿瘤体细胞突变检测不足第27页液态活检(L

14、iquid Biopsy)Speicher M R, Pantel K. Tumor signatures in the bloodJ. Nature biotechnology, , 32(5): 441-443.循环肿瘤细胞 (Circulating tumor cells, CTCs)游离肿瘤DNA (Circulating tumor DNA, ctDNA)当前看，ctDNA更适合做液态活检第28页作为无法获取组织标本补充，无创取样后检测结果指导临床用药实现实时动态监测，预测耐药及复发 提升全程管理水平指导用药实时监测循环而匀质血液标本，在一定程度有效克服异质性匀质标本未来可用ctDNA血液检测进行突变状态动态耐药复发监测第29页肿瘤类型繁多，分子突变特点不一；高灵敏度定性、定量检测，技术分辨率要求高；ctDNA起源复杂，不一样肿瘤患者个体差异较大，数据解读与注释需慎重；当前仍局限于晚期肿瘤临床应用；需要大规模、多中心临床验证数据。ctDNA检测技术面临挑战第30页对NGS在肿瘤应用思索肿瘤风险易感基因检测对诊疗价值？ 数据库积累？预测精准性？ 23and me？11月26日，FDA叫停 健康基因检测服务。 年3月：同意其布卢姆综合症基因携带者检测服务(一个隐性遗传病)。 BRCA1、BRCA2-乳腺癌易感基因，药品靶点（奥拉帕尼）2. 肿瘤相关